Engineering biotin prototrophic Corynebacterium glutamicum strains for amino acid, diamine and carotenoid production
- 作者
- P. Peters-Wendisch, S. Götker, S.A.E. Heider, G. Komati Reddy, A.Q. Nguyen, K.C. Stansen, V.F. Wendisch
- 单位
- Genetics of Prokaryotes, Faculty of Biology and CeBiTec, Bielefeld University, Bielefeld, Germany
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2014.01.023
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是生物素营养缺陷型，缺乏生物素合成途径中的关键酶（如BioF）及前体合成能力，导致在不添加生物素的培养基中无法生长和生产目标产物，增加了工业发酵成本。
研究策略
通过异源表达生物素生物合成基因：在大肠杆菌中表达bioF（单独或与bioC、bioH一起）不足以实现原养型；在枯草芽孢杆菌中表达完整的bioWAFDBI操纵子，使谷氨酸棒杆菌获得从头合成生物素的能力，并在此背景下评估多种产物的生产。
核心内容
该研究针对谷氨酸棒杆菌作为生物素营养缺陷型菌株、需外源添加生物素才能生长和生产的瓶颈，探索了通过异源表达生物素合成基因实现生物素原养型的策略。研究者首先尝试在大肠杆菌中表达bioF或bioFCH基因，发现单独或组合表达均无法赋予谷氨酸棒杆菌无生物素生长能力；随后异源表达枯草芽孢杆菌的完整bioWAFDBI操纵子，成功使野生型菌株在无生物素培养基中稳定生长约52代，而空载体对照在第二次传代后即无法生长。在此原养型菌株背景下，L-赖氨酸生产菌株产生约13 mM赖氨酸，L-精氨酸生产菌株产生约25 mM精氨酸，腐胺产量为2–5 mM，番茄红素积累约3–6 μM，各产物产量均与添加生物素的对照相当。研究还发现，额外添加pimelic acid并不能加速原养型菌株的生长，提示BioI与BioW途径间不存在协同作用。该工作证明异源表达枯草芽孢杆菌完整生物素操纵子是将谷氨酸棒杆菌转变为生物素原养型的通用策略，可简化培养基并降低工业发酵成本，适用于多种氨基酸、二胺和类胡萝卜素的生产体系。
创新点
['首次在谷氨酸棒杆菌中异源表达枯草芽孢杆菌的完整生物素合成操纵子bioWAFDBI，成功实现生物素原养型生长', '证明了大肠杆菌BioC-BioH途径在谷氨酸棒杆菌中不适用，而枯草芽孢杆菌BioI-BioW途径可行', '将生物素原养型策略应用于L-赖氨酸、L-精氨酸、腐胺和番茄红素的生产，简化了培养基成本']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium glutamicum | biotin biosynthesis | bioW | pimeloyl-CoA synthetase | 催化 | 来自Bacillus subtilis，异源表达，激活pimelic acid生成pimeloyl-CoA |
| Corynebacterium glutamicum | biotin biosynthesis | bioA | 7,8-diaminononanoate synthase | 催化 | 来自Bacillus subtilis，异源表达，参与生物素环合成 |
| Corynebacterium glutamicum | biotin biosynthesis | bioF | 8-amino-7-oxononanoate synthase | 催化 | 来自Bacillus subtilis，异源表达，补齐C. glutamicum缺失的BioF |
| Corynebacterium glutamicum | biotin biosynthesis | bioD | dethiobiotin synthase | 催化 | 来自Bacillus subtilis，异源表达 |
| Corynebacterium glutamicum | biotin biosynthesis | bioB | biotin synthase | 催化 | 来自Bacillus subtilis，异源表达 |
| Corynebacterium glutamicum | biotin biosynthesis | bioI | cytochrome P450 hydroxylase | 催化 | 来自Bacillus subtilis，异源表达，氧化裂解脂肪酸合成中间体生成pimeloyl-ACP |
| Corynebacterium glutamicum | biotin biosynthesis | bioF | 8-amino-7-oxononanoate synthase | 催化 | 来自Escherichia coli，异源表达，添加pimelic acid时可支持无生物素生长 |
| Corynebacterium glutamicum | biotin biosynthesis | bioC | malonyl-CoA O-methyltransferase | 催化 | 来自Escherichia coli，异源表达，与bioH一起未能实现生物素原养型 |
| Corynebacterium glutamicum | biotin biosynthesis | bioH | pimeloyl-ACP methyl ester esterase | 催化 | 来自Escherichia coli，异源表达，与bioC一起未能实现生物素原养型 |
| Corynebacterium glutamicum | biotin metabolism | bioYMN | biotin uptake system | 转运 | 内源生物素摄取系统，由bioY、bioM、bioN编码 |
| Corynebacterium glutamicum | biotin metabolism | bioQ | biotin transcriptional regulator | 调控 | 内源TetR型转录调控因子，负调控生物素代谢基因 |
| Corynebacterium glutamicum | biotin metabolism | birA | biotin protein ligase | 催化 | 内源生物素蛋白连接酶，负责将生物素连接到Pyruvate carboxylase和Acetyl-CoA carboxylase |
关键发现
['表达大肠杆菌bioF的C. glutamicum WT在添加20 mg/L pimelic acid时可无生物素生长，但单独表达bioF或bioFCH均不能实现生物素原养型', '异源表达枯草芽孢杆菌bioWAFDBI使C. glutamicum WT在无生物素培养基中稳定生长8次传代，约52代，315小时，而空载体对照在第二次传代后无法生长', '在无生物素培养基中，L-赖氨酸生产菌株DM1933(pEKEx3-bioWAFDBI)生长并产生约13 mM L-赖氨酸，与含生物素对照相当', 'L-精氨酸生产菌株ARG2(pEKEx3-bioWAFDBI)在无生物素培养基中产生约25 mM L-精氨酸', '腐胺生产菌株PUT21(pEKEx3-bioWAFDBI)在无生物素培养基中产生2-5 mM腐胺', '番茄红素生产菌株LYC1(pEKEx3-bioWAFDBI)在无生物素培养基中积累约3-6 μM番茄红素', '添加pimelic acid（5或20 mg/L）不能加速生物素原养型菌株的生长，提示BioI和BioW途径不协同']
研究结论
异源表达枯草芽孢杆菌的bioWAFDBI操纵子可将谷氨酸棒杆菌转变为生物素原养型，并支持在无生物素培养基中高效生产氨基酸、二胺和类胡萝卜素，为降低工业发酵成本和避免生物素限制提供了一种通用策略。