Engineering Escherichia coli for selective geraniol production with minimized endogenous dehydrogenation
- 作者
- Jia Zhou, Chonglong Wang, Sang-Hwal Yoon, Hui-Jeong Jang, Eui-Sung Choi, Seon-Won Kim
- 单位
- Division of Applied Life Science (BK21 Plus), PMBBRC, Gyeongsang National University; Industrial Biotechnology Research Center, KRIBB
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2013.11.009
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中香叶醇产量低，且内源脱氢和异构化导致香叶醇转化为其他香叶醇类副产物，影响产量和纯度。
研究策略
通过组合外源甲羟戊酸（MVA）途径增强IPP/DMAPP前体供给，使用源自大肠杆菌FPPS的突变型GPP合酶（GPPS）合成GPP，引入罗勒截短香叶醇合酶（tObGES）将GPP转化为香叶醇；同时鉴定并敲除内源香叶醇脱氢酶基因yigB，以阻断香叶醇降解，最终实现选择性高产香叶醇。
核心内容
该研究针对大肠杆菌中香叶醇产量低且内源脱氢导致产物纯度不足的问题，通过系统代谢工程改造实现选择性高产。研究者组合表达肺炎链球菌甲羟戊酸途径下游基因以增强IPP/DMAPP前体供给，引入大肠杆菌FPPS的S80F突变型GPP合酶合成GPP，并表达罗勒截短香叶醇合酶（tObGES）将GPP转化为香叶醇；同时鉴定出内源醇脱氢酶YigB是导致香叶醇脱氢降解的主要酶，并予以敲除。结果表明，仅共表达GPP合酶和MVA下游途径时香叶醇产量为13.3 mg/L，引入tObGES后升至105.2 mg/L；敲除yigB后产量进一步达129.7 mg/L，且纯度从78%提升至98%。整合完整MVA途径后，在yigB敲除菌株中48小时香叶醇产量达到182.5 mg/L，约为含YigB对照株（96.5 mg/L）的两倍，为当时微生物合成香叶醇的最高报道水平。该工作说明阻断宿主内源混杂脱氢活性是提高单萜产物选择性和产量的有效策略，可推广至其他因宿主内源代谢导致产物损失的合成生物学体系。
创新点
首次在大肠杆菌中系统整合前体供给、GPP合成与GPP转化三方面；发现并验证YigB是内源香叶醇脱氢化的主要酶；通过敲除yigB将香叶醇纯度从78%提高至98%，并实现最高182.5 mg/L的产量。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 | 类异戊二烯前体合成 | ispA (S80F突变) | GPPS（突变型法尼基焦磷酸合酶） | 催化 | 通过定点突变Ser80Phe将大肠杆菌FPPS转化为GPP合酶，用于合成GPP。 |
| Escherichia coli MG1655 | 单萜合成 | ObGES (截短，去除N端65个氨基酸) | tObGES（罗勒香叶醇合酶） | 催化 | 催化GPP脱磷酸生成香叶醇。 |
| Escherichia coli MG1655 | 外源甲羟戊酸（MVA）途径 | mvaE, mvaS | MvaE（双功能乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶），MvaS（HMG-CoA合酶） | 催化 | 来自粪肠球菌，构成MVA途径上游模块，合成甲羟戊酸。 |
| Escherichia coli MG1655 | 外源甲羟戊酸（MVA）途径 | mvaK1, mvaK2, mvaD | MvaK1（甲羟戊酸激酶），MvaK2（磷酸甲羟戊酸激酶），MvaD（甲羟戊酸二磷酸脱羧酶） | 催化 | 来自肺炎链球菌，构成MVA途径下游模块，将甲羟戊酸转化为IPP和DMAPP。 |
| Escherichia coli MG1655 | IPP/DMAPP异构化 | idi | IDI（异戊烯基二磷酸异构酶） | 催化 | 来自大肠杆菌，促进IPP与DMAPP互变。 |
| Escherichia coli MG1655 | 内源香叶醇脱氢/降解 | yigB | YigB（乙醇脱氢酶/醛还原酶） | 催化 | 香叶醇脱氢酶候选，被鉴定为主要催化香叶醇脱氢生成香叶醛的酶；敲除该基因可显著减少香叶醇损失。 |
| Escherichia coli MG1655 | 内源香叶醇脱氢/降解 | yahK | YahK（乙醇脱氢酶） | 催化 | 香叶醇脱氢酶候选，过表达时对香叶醇有活性，但天然条件下作用不显著。 |
| Escherichia coli MG1655 | 内源香叶醇脱氢/降解 | yddN | YddN（NADH依赖的中链醇脱氢酶/乙醛还原酶） | 催化 | 香叶醇脱氢酶候选，过表达时显示活性，但敲除后对香叶醇转化影响不大。 |
关键发现
- 重组共表达大肠杆菌GPPS（ispA S80F突变）和肺炎链球菌MVA途径下游（pSTKSN12Didi）后，香叶醇产量为13.3 mg/L
- 额外引入罗勒tObGES（GEOLB）使香叶醇产量提高到105.2 mg/L（48 h）
- 敲除yigB后（KGEOLB）产量升至129.7 mg/L，纯度从78%增至98%
- 进一步引入完整MVA途径（pSNAK）并在yigB敲除菌株（KGEOLW）中，48 h香叶醇产量达182.5 mg/L，是含YigB的野生型对照株GEOLW（96.5 mg/L）的约2倍
- 当使用完整MVA途径时，GEOLW中香叶醇脱氢速率（0.43 mg/L/h/OD600）是仅用MVA下游的GEOLB（0.14 mg/L/h/OD600）的3倍
- 总香叶醇类产量在GEOLW和KGEOLW中分别达197.5 mg/L和187.0 mg/L。
研究结论
通过增强前体供给、优化GPP合成与转化，并删除内源主要香叶醇脱氢酶基因yigB，成功在大肠杆菌中实现182.5 mg/L的香叶醇产量，为当时微生物合成香叶醇的最高水平；该策略可推广至其他因宿主内源混杂代谢活性导致产物损失的代谢工程体系。