Overproduction of geraniol by enhanced precursor supply in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Jidong Liu, Weiping Zhang, Guocheng Du, Jian Chen, Jingwen Zhou
- 单位
- Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education and School of Biotechnology, Jiangnan University; School of Light industry and Food Engineering, Guangxi University
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2013.10.017
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母缺乏高效的单萜合成能力，甲羟戊酸途径通量弱，GPP前体供应不足，导致香叶醇产量低，且关键限速步骤不明确。
研究策略
在酿酒酵母中引入香叶醇合酶，通过过表达截短的HMG-CoA还原酶(tHMG1)、IPP异构酶(IDI1)、tRNA生物合成负调控因子MAF1以及FPPS突变体ERG20K197G，逐步增强甲羟戊酸途径通量并重新分配GPP/FPP合成，提高香叶醇前体GPP的供给。
核心内容
本研究以酿酒酵母CEN.PK2-1C为底盘，系统代谢工程改造甲羟戊酸途径以提升单萜香叶醇产量。首先引入香叶醇合酶，经密码子优化和基因组整合后产量由0.52 mg/L提至0.73 mg/L。随后逐级过表达截短HMG-CoA还原酶tHMG1、IPP异构酶IDI1、tRNA合成负调控因子MAF1及FPPS突变体ERG20K197G，发现多拷贝过表达IDI1使产量达1.62 mg/L，较单拷贝整合提高约65%，证实IDI1为主要限速酶。组合过表达IDI1与tHMG1后产量升至6.77 mg/L，进一步增加MAF1使产量翻倍，最终引入ERG20K197G实现GPP/FPP通量再分配，产量达36.04 mg/L，较初始菌株提高近70倍。鲨烯浓度随改造逐步上升至对照的40.3倍，表明碳流大部分仍导向FPP分支。该工作明确了IDI1的关键限速作用，验证了MAF1通过减少DMAPP向tRNA分流来增强GPP供给的新策略，但甲羟戊酸途径整体通量仍是进一步提升单萜产量的主要瓶颈。
创新点
['首次系统鉴定了IPP异构酶(IDI1)为酿酒酵母香叶醇生物合成的限速酶', '发现过表达tRNA生物合成负调控因子MAF1可通过减少DMAPP向tRNA方向分流来增加GPP合成', '组合过表达ERG20K197G突变体实现GPP/FPP合成通量的重新分配，大幅提高香叶醇产量']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 单萜（香叶醇）生物合成 | GES1/coGES1 | geraniol synthase（香叶醇合酶） | 催化 | 来自罗勒(Ocimum basilicum)，催化GPP生成香叶醇；密码子优化版本coGES1表达效果更好 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase) | 催化 | 截短形式可绕过固醇反馈抑制，增强甲羟戊酸途径通量 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 甲羟戊酸途径 | IDI1 | 异戊烯基二磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase) | 催化 | 催化IPP异构化为DMAPP，是香叶醇生物合成的限速酶；多拷贝过表达优于单拷贝 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | tRNA生物合成调控（影响甲羟戊酸途径DMAPP分配） | MAF1 | Maf1p（tRNA生物合成负调控因子） | 调控 | 过表达MAF1抑制tRNA合成，减少DMAPP向tRNA方向分流，使更多DMAPP用于GPP合成 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 甲羟戊酸途径（GPP/FPP合成） | ERG20K197G | 法尼基二磷酸合酶突变体(Farnesyl diphosphate synthase, FPPS) | 催化 | K197G突变使FPPS释放更多GPP，增强GPP池并重新分配GPP/FPP合成 |
关键发现
- 野生型香叶醇合酶表达产量仅0.52 mg/L
- 密码子优化(coGES1)提高40.4%至0.73 mg/L
- 基因组整合coGES1比游离表达提高26.9%
- 过表达tHMG1使产量达到1.57 mg/L（比对照JN04高1.38倍）
- 多拷贝过表达IDI1产量为1.62 mg/L（提高1.45倍），而单拷贝基因组整合仅0.98 mg/L（提高50%），证明IDI1是限速酶
- 组合过表达IDI1和tHMG1使产量升至6.77 mg/L
- 进一步过表达MAF1使产量增加102%
- 最终组合ERG20K197G使产量达到36.04 mg/L。鲨烯浓度相对JN04的倍数变化：JN05为2.8倍，JN06为6.0倍，JN07为0.6倍，JN08为16.4倍，JN09为24.9倍，JN10为40.3倍。
研究结论
通过代谢工程改造酿酒酵母甲羟戊酸途径可显著提高香叶醇产量，IDI1是关键的限速酶，过表达MAF1和ERG20K197G是有效策略，但甲羟戊酸途径的前体供给仍是进一步提升单萜产量的主要瓶颈。