高级醇 · 代谢工程文献库

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Evaluation of tobacco (Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1) hairy roots for the production of geraniol, the first committed step in terpenoid indole alkaloid pathway

作者
Anneli Ritala, Lemeng Dong, Nicole Imseng, Tuulikki Seppänen-Laakso, Nikolay Vasilev, Sander van der Krol, Heiko Rischer, Hannu Maaheimo, Arho Virkki, Johanna Brändli, Stefan Schillberg, Regine Eibl, Harro Bouwmeester, Kirsi-Marja Oksman-Caldentey
单位
VTT Technical Research Centre of Finland, P.O. Box 1000, Tietotie 2, 02044-VTT Espoo, Finland; Laboratory of Plant Physiology, Wageningen UR, P.O. Box 658, 6700 AR Wageningen, The Netherlands; Zurich University of Applied Sciences, Institute of Biotechnology, Biochemical Engineering and Cell Cultivation Technique, Campus Gruiental, Wädenswil, Switzerland; Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology (IME), Forckenbeckstrasse 6, 52074 Aachen, Germany
杂志
Journal of Biotechnology（2014）
DOI
10.1016/j.jbiotec.2014.01.031
所属领域
代谢工程
关键词
GeraniolHairy rootTerpenoid indole alkaloidTobaccoTransgenic
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解决的核心问题

评估烟草毛状根作为生产萜类吲哚生物碱（TIA）途径第一步香叶醇的平台，因为烟草毛状根天然不产生香叶醇，需要通过异源表达和生物反应器放大验证其可行性。

研究策略

利用发根农杆菌LBA9402介导转化，在烟草（Petit Havana SR1）毛状根中稳定表达来自缬草（Valeriana officinalis）的香叶醇合酶基因VoGES（带人工质体靶向信号），建立SPME-GC-MS快速筛选产香叶醇克隆的方法，通过GC-MS、LC-QTOF-MS和NMR分析代谢产物，并在2L和20L波浪混合/轨道摇瓶一次性生物反应器中开展批次和补料分批培养及放大研究。

研究路线图

100%
研究问题：评估烟草毛状根（SR1）异源表达VoGES生产香叶醇（TIA途径第一步）的可行性
策略：LBA9402介导转化SR1毛状根，稳定表达质体靶向VoGES；建立SPME-GC-MS快速筛选克隆；开展2L/20L生物反应器培养
改造①：构建VoGES表达载体（含人工质体靶向序列，双增强35S启动子，潮霉素筛选）
改造②：农杆菌介导转化SR1，诱导毛状根；PCR/qPCR验证VoGES整合
改造③：SPME-GC-MS快速筛选20个克隆，获高产克隆（最高31.3 μg/g DW游离香叶醇）
改造④：GC-MS/LC-QTOF-MS/NMR鉴定6种香叶醇糖苷衍生物（己糖/戊糖结合物）
结果：2L批次/补料分批培养干重1.6g/1.4g；补料分批生物量增56%，总香叶醇164.9 μg/g DW；20L放大获10.7g DW，总香叶醇204.3 μg/g DW，每袋2.2 mg（比2L高5.3倍）
结论：VoGES质体靶向表达实现了烟草毛状根生产香叶醇（概念验证）；大部分糖苷化；20L规模毫克级产量，具商业化潜力；未来需改造MEP通量/抑制氧化/引入分泌
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核心内容

本研究通过发根农杆菌LBA9402介导转化，在烟草（Petit Havana SR1）毛状根中异源表达了带质体靶向信号的缬草香叶醇合酶基因VoGES，成功构建了可稳定生产香叶醇的毛状根体系。研究建立了SPME-GC-MS快速筛选高产克隆的方法，从20个阳性克隆中获得游离香叶醇平均含量13.7 μg/g DW，最高达31.3 μg/g DW；经去糖基化后总香叶醇最高达204.3 μg/g DW，并鉴定出6种香叶醇及羟基香叶醇的己糖/戊糖糖苷衍生物，表明绝大部分产物被糖苷化储存。工艺放大方面，2L生物反应器中波浪混合袋和轨道摇瓶袋的总香叶醇分别为162.6和173.1 μg/g DW；补料分批模式使干重增加56%，每袋总产量为批次的1.6倍；进一步放大至20L波浪混合袋后获得10.7 g DW生物量，总香叶醇浓度204.3 μg/g DW，每袋总产量2.2 mg，为2L规模的5.3倍。此外VoGES表达未显著改变烟草主要生物碱含量。该研究首次证明表达质体靶向香叶醇合酶的烟草毛状根可在20L规模实现毫克级香叶醇生产，展示了其作为TIA途径关键前体生产平台的可行性，为后续提高产量提供了产量潜力与糖苷化代谢特征等关键参考依据。

创新点

首次在烟草毛状根中异源表达质体靶向VoGES并成功生产香叶醇；开发了SPME-GC-MS快速筛选高产克隆的方法；鉴定出6种香叶醇和羟基香叶醇的己糖/戊糖糖苷衍生物；实现了20L波浪混合生物反应器的工艺放大，每袋获得毫克级香叶醇。

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
烟草（Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1）毛状根 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成通路（香叶醇合成支路） VoGES 香叶醇合酶（geraniol synthase） 催化 来自缬草（Valeriana officinalis），带人工质体靶向序列，由双增强CaMV 35S启动子驱动，催化GPP生成香叶醇，是TIA途径的第一个关键步骤。
烟草（Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1）毛状根 发根农杆菌介导的毛状根诱导 rolB — 调控 来自发根农杆菌LBA9402，用于诱导毛状根形成，是遗传转化筛选标记。

关键发现

  1. 在20个表达VoGES的毛状根克隆中，游离香叶醇平均含量为13.7 μg/g DW，最高为31.3 μg/g DW
  2. 经去糖基化后总香叶醇含量最高达204.3 μg/g DW，其中香叶醇衍生物以6种主要糖苷形式存在（己糖/戊糖与香叶醇/羟基香叶醇的结合物）。在2L生物反应器批次培养中，波浪混合袋和轨道摇瓶袋的最终干重分别为1.6 g和1.4 g，总香叶醇分别为162.6 μg/g DW和173.1 μg/g DW
  3. 补料分批模式使干重比批次增加56%，平均总香叶醇为164.9 μg/g DW，由于生物量增加，每袋总香叶醇产量是批次的1.6倍。放大至20L波浪混合袋后，最终总生物量为185.3 g FW（10.7 g DW），总香叶醇浓度为204.3 μg/g DW，每袋总产量2.2 mg，比2L袋高5.3倍。此外，VoGES表达未显著改变烟草主要生物碱（烟碱、新烟碱、安那他品等）含量。

研究结论

本研究证明了利用表达质体靶向香叶醇合酶的基因工程烟草毛状根生产香叶醇的概念验证；游离香叶醇含量仅反映总积累量的一小部分，因为大部分香叶醇被糖苷化；20L规模生产成功获得毫克级香叶醇，表明该平台具有商业化潜力。未来可通过进一步改造TIA通路（如增强MEP通量、抑制氧化副反应、引入分泌机制）来提高产量。