OptEnvelope: A target point guided method for growth-coupled production using knockouts
- 作者
- Ehsan Motamedian, Kristaps Berzins, Reinis Muznieks, Egils Stalidzans
- 单位
- Institute of Microbiology and Biotechnology, Computational Systems Biology Group, University of Latvia, Riga, Latvia
- 杂志
- PLoS ONE（2023）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0294313
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用代谢模型找到使生物质生长与目标代谢物生产相偶联的最佳基因敲除策略
研究策略
提出OptEnvelope三步法：1) 用户选择野生型产物-生物量产率包络中的目标点；2) 用MILP求解目标点的最小活性反应集(MAR)，删除非MAR反应获得新的生长偶联包络；3) 重新插入被删反应以最小化敲除数量，同时保持期望包络。通过切换目标点至包络内部搜索更多候选包络，并支持限制最大敲除数。
核心内容
该研究提出了一种名为OptEnvelope的计算方法，用于在代谢模型中寻找使细胞生长与目标代谢物生产相偶联的最佳基因敲除策略。该方法采用三步流程：首先让用户在野生型产物—生物量产率包络上指定一个目标点；随后通过混合整数线性规划求解该目标点对应的最小活性反应集，删除非必需反应以生成新的偶联包络；最后重新插入被删反应以最小化敲除数量，同时维持期望的包络特性。OptEnvelope还能通过切换目标点至包络内部来搜索更多候选方案，并支持限制最大敲除数量。在大肠杆菌好氧产乙酸的案例中，该方法预测出10个候选包络，其中仅需3个敲除（针对ATP合酶、琥珀酰辅酶A合成酶和磷酸甘油酸变位酶）的方案即可实现最小产量7.6、最大产量25.6 mmol/gDCW/h的偶联效果，而主包络需8个敲除，最大生长速率由野生型的0.91降至0.24 1/h。跨宿主比较显示，大肠杆菌更适合乙酸和琥珀酸生产（最大理论产量分别达0.91和1.12 g/g），而酿酒酵母更适合甘油和乙醇生产（最大理论产量分别为0.81和0.51 g/g），且所需敲除数量显著更少。这些结果表明，OptEnvelope能够系统比较不同基因敲除策略和宿主代谢特性，为菌株设计提供定量指导。
创新点
目标点导向的包络搜索策略，先求包络再求敲除；可系统评估多个内部目标点，发现多样化的候选包络；支持限制敲除数量；可快速比较不同宿主的生产潜力。
研究对象（22）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 乙酸生产 | atpFH | ATP合酶亚基 | 能量供给 | 实验验证敲除基因，提高乙酸产量 |
| Escherichia coli | 乙酸生产 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 实验验证敲除基因，阻断乳酸分支 |
| Escherichia coli | 乙酸生产 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 实验验证敲除基因，调节乙酸生成 |
| Escherichia coli | 乙酸生产 | adhE | 乙醛脱氢酶/乙醇脱氢酶 | 催化 | 实验验证敲除基因，减少乙醇分流 |
| Escherichia coli | 乙酸生产 | — | ATP合酶 (ATPS4r) | 能量供给 | OptEnvelope预测的敲除反应，出现在多个包络中 |
| Escherichia coli | 乙酸生产 | — | 琥珀酰辅酶A合成酶 (SUCOAS) | 催化 | OptEnvelope预测的敲除反应，仅需3个敲除的包络包含 |
| Escherichia coli | 乙酸生产 | — | 磷酸甘油酸变位酶 (PGM) | 催化 | OptEnvelope预测的敲除反应，3敲除包络之一 |
| Escherichia coli | 乙酸生产 | — | 磷酸果糖激酶 (PFK) | 催化 | OptEnvelope预测的常见敲除反应 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甘油生产 | tpi1 | 磷酸丙糖异构酶 | 催化 | 实验验证敲除基因，促进甘油积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甘油生产 | adh1 | 乙醇脱氢酶1 | 催化 | 实验验证敲除基因，减少乙醇生成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甘油生产 | gpd1 | 甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 实验验证过表达基因，提高甘油产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甘油生产 | ald3 | 乙醛脱氢酶3 | 催化 | 实验验证过表达基因，辅助NADH平衡 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甘油生产 | — | NADH脱氢酶 (NADH2_u6cm) | 能量供给 | OptEnvelope预测敲除反应，与NADH平衡相关 |
| Escherichia coli | 琥珀酸生产 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 实验验证敲除基因，减少副产物乳酸 |
| Escherichia coli | 琥珀酸生产 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 实验验证敲除基因，减少乙酸生成 |
| Escherichia coli | 琥珀酸生产 | citF | 柠檬酸裂解酶亚基 | 催化 | 实验验证敲除基因，改变碳流分配 |
| Escherichia coli | 琥珀酸生产 | ptsGH | 磷酸转移酶系统IIA成分 | 转运 | 实验验证敲除基因，影响葡萄糖摄取 |
| Escherichia coli | 乙醇生产 | zwf | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 实验验证敲除基因，减少戊糖磷酸途径碳流 |
| Escherichia coli | 乙醇生产 | ndh | NADH脱氢酶 | 能量供给 | 实验验证敲除基因，调节NADH水平 |
| Escherichia coli | 乙醇生产 | pdc | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 异源基因（来自运动发酵单胞菌），提高乙醇产量 |
| Escherichia coli | 乙醇生产 | adhB | 乙醇脱氢酶B | 催化 | 异源基因（来自运动发酵单胞菌），提高乙醇产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醇生产 | — | 乙醇脱氢酶 | 催化 | 天然乙醇生产通路的关键酶，野生型即可高产量 |
关键发现
- 在大肠杆菌好氧产乙酸案例中，OptEnvelope预测出10个包络：primary包络的最大/最小/MP点产量分别为27.49、4.47、21.39 mmol/gDCW/h，最大生长速率从野生型0.91 1/h降至0.24 1/h，需8个敲除
- 第8个包络仅需3个敲除（ATPS4r、SUCOAS、PGM），最小产量7.6，最大25.6 mmol/gDCW/h
- 第2个包络需6个敲除，最小产量9.5，最大27.07 mmol/gDCW/h，MP点产量22.68 mmol/gDCW/h。宿主比较：乙酸生产上E. coli最大产量0.91 g/g，S. cerevisiae为0.87 g/g，E. coli在MP点得率0.71 g/g（理论最大值的78%），S. cerevisiae为0.6 g/g（69%），E. coli需8个敲除而S. cerevisiae需58个
- 甘油生产上S. cerevisiae最大理论产量0.81 g/g，E. coli仅0.48 g/g，S. cerevisiae可实现最小甘油产量0.03 g/g且MP点产量0.6 g/g需7个敲除，而E. coli无法强偶联
- 琥珀酸（厌氧）上E. coli最大理论产量1.12 g/g，S. cerevisiae为0.84 g/g，E. coli最小产量0.93 g/g、MP点产量1.1 g/g需9个敲除，S. cerevisiae需46个
- 乙醇上两者最大理论产量均为0.51 g/g，野生型S. cerevisiae在最大厌氧生长时乙醇得率0.45 g/g（88%理论值）需6个敲除，E. coli经设计后乙醇得率从0.12提高到0.466 g/g（91%理论值）需8个敲除。
研究结论
OptEnvelope能够有效预测生长偶联的基因敲除策略，并通过比较多个包络指导菌株设计；结合宿主天然代谢特性，E. coli更适合乙酸和琥珀酸生产，S. cerevisiae更适合甘油和乙醇生产，实验结果与预测趋势一致。