Analysis of Zobellella denitrificans ZD1 draft genome: Genes and gene clusters responsible for high polyhydroxybutyrate (PHB) production from glycerol under saline conditions and its CRISPR-Cas system
- 作者
- Yu-Wei Wu, Shih-Hung Yang, Myung Hwangbo, Kung-Hui Chu
- 单位
- Graduate Institute of Biomedical Informatics, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, Taipei, Taiwan; Clinical Big Data Research Center, Taipei Medical University Hospital, Taipei, Taiwan; Zachry Department of Civil and Environmental Engineering, Texas A&M University, College Station, TX, United States of America
- 杂志
- PLoS ONE（2019）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0222143
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明Zobellella denitrificans ZD1在盐胁迫下利用非灭菌粗甘油高产PHB的遗传机制，包括甘油转化PHB的完整通路、新型PHB合成基因簇、耐盐基因簇、反硝化与同化硝酸盐还原基因以及CRISPR-Cas系统。
研究策略
对ZD1菌株进行基因组组装与注释，结合系统发育分析（ezTree、FastTree）、基因簇搜索（多基因组BLASTP）、实时荧光定量PCR（qPCR）检测PHB合成基因表达，以及SDS-PAGE验证ectoine合成蛋白表达，全面解析与PHB生产、耐盐和氮代谢相关的遗传元件。
核心内容
对Zobellella denitrificans ZD1进行基因组组装与注释，解析其在高盐条件下利用粗甘油高产PHB的遗传基础。基因组大小为4,501,699 bp，GC含量63.78%。鉴定出一个新型四基因PHB合成基因簇phaB-phaA-PFP-phaC，其中PFP位于phaC与phaA之间属首次报道，该基因簇在117种细菌中保守存在。以硝酸盐为氮源时PHB产量达16.3 g/L，显著高于铵盐的9.5 g/L；qPCR显示硝酸盐使phaA表达上调最高8.1倍、phaB最高12.8倍，证实氮源类型对PHB合成基因具有转录调控作用。基因组还包含ectoine合成基因簇、完整反硝化与同化硝酸盐还原通路，以及含117个spacer的CRISPR-Cas系统。这些结果从基因组层面解释了ZD1在盐胁迫和非灭菌条件下高效积累PHB的机制，为利用该菌株进行经济型PHB生产提供了遗传学依据。
创新点
发现并表征了一个新型PHB合成基因簇（phaB-phaA-PFP-phaC），其中PFP基因位于phaC与phaA之间，此前未见报道；发现该基因簇在海生Gammaproteobacteria中高度保守；揭示了硝酸盐作为氮源可显著上调PHB合成基因表达（phaA最高8.1倍、phaB最高12.8倍）。
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Zobellella denitrificans ZD1 | 甘油利用 | glpF | GlpF | 转运 | 甘油促进因子，负责将甘油转运进入细胞 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | 甘油利用 | glpK | GlpK | 催化 | 甘油激酶，将甘油转化为3-磷酸甘油 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | PHB合成 | phaA | PhaA | 催化 | β-酮硫解酶，催化乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA |
| Zobellella denitrificans ZD1 | PHB合成 | phaB | PhaB | 催化 | 乙酰乙酰-CoA还原酶，催化生成(R)-3-羟基丁酰-CoA |
| Zobellella denitrificans ZD1 | PHB合成 | phaC | PhaC | 催化 | PHB合酶，催化PHB聚合形成颗粒 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | PHB合成 | PFP | PFP | 区室化 | phasin家族蛋白，位于phaC与phaA之间，属新型PHB基因簇成员，参与PHB颗粒形成 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | PHB合成 | phaP | PhaP | 区室化 | phasin蛋白，结合PHB颗粒，促进颗粒形成 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | PHB合成 | phaR | PhaR | 调控 | phasin转录因子，结合phaP启动子区域并阻遏其表达 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | 耐盐渗透物（ectoine）合成 | ectA | EctA | 催化 | L-二氨基丁酸乙酰转移酶，参与ectoine合成 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | 耐盐渗透物（ectoine）合成 | ectB | EctB | 催化 | 二氨基丁酸转氨酶，参与ectoine合成 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | 耐盐渗透物（ectoine）合成 | ectC | EctC | 催化 | ectoine合成酶，催化ectoine生成 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | 反硝化 | napFDAGHBC | NapF, NapD, NapA, NapG, NapH, NapB, NapC | 催化 | 周质硝酸盐还原酶复合体，将硝酸盐还原为亚硝酸盐 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | 反硝化 | nirK | NirK | 催化 | 铜型亚硝酸盐还原酶，将亚硝酸盐还原为一氧化氮 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | 反硝化 | norB | NorB | 催化 | 一氧化氮还原酶（qNorB型），将一氧化氮还原为一氧化二氮 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | 反硝化 | nosZ | NosZ | 催化 | 氧化亚氮还原酶，将氧化亚氮还原为氮气 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | 同化硝酸盐还原 | nasFEDRACB | NasF, NasE, NasD, NasR, NasA, NasC, NasB | 催化 | 同化硝酸盐还原基因簇，将硝酸盐转运并还原为氨 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | 同化亚硝酸盐还原 | nirB, nirD | NirB, NirD | 催化 | NADH依赖的亚硝酸盐还原酶，将亚硝酸盐还原为氨 |
| Zobellella denitrificans ZD1 | 病毒防御（CRISPR-Cas） | cas1, cas2, cas3HD, cas5, cas6e, cas7, cas8e, cse2gr11 | Cas1, Cas2, Cas3HD, Cas5, Cas6e, Cas7, Cas8e, Cse2 | 催化 | I-E型CRISPR-Cas系统，含117个spacer，赋予抗噬菌体能力 |
关键发现
- ZD1基因组大小为4,501,699 bp，GC含量63.78%，N50为33,403 bp
- 以硝酸盐为氮源时PHB产量达16.3 g/L，而以铵盐为氮源时为9.5 g/L
- 硝酸盐培养条件下phaA表达上调2.5-8.1倍、phaB上调4.4-12.8倍、phaC上调3.1-3.4倍、PFP上调0.8-2.2倍
- 鉴定出4基因PHB合成基因簇，在117个细菌物种中存在，其中Vibrio属占55.6%
- 3% NaCl条件下菌株可积累PHB达3.61 g/L（C/N=21.5）
- ectoine合成蛋白EctA约19 kDa、EctB约45 kDa、EctC约15 kDa
- CRISPR-Cas系统含117个spacer，其中52个（44%）属于dsDNA病毒，约12%属于其他RNA/DNA病毒，另有44%无法匹配。
研究结论
ZD1基因组中包含从甘油到PHB的完整生物合成通路，其新型PHB合成基因簇（phaB-phaA-PFP-phaC）和盐耐受基因簇（ectA-ectB-ectC）解释了该菌在盐胁迫下利用非灭菌粗甘油高效生产PHB的能力；同时完整的反硝化和同化硝酸盐还原基因簇揭示了其氮代谢潜力，而丰富的CRISPR-Cas系统赋予其抗噬菌体能力。该研究为利用ZD1进行经济、非灭菌的PHB生产提供了基因组学基础。