Construction of a pathway to \(C_{50}\) - \(\epsilon\) -carotene
- 作者
- Yusuke Otani, Takashi Maoka, Shigeko Kawai-Noma, Kyoichi Saito, Daisuke Umeno
- 单位
- Department of Applied Chemistry and Biotechnology, Chiba University, Chiba, Japan; Research Institute for Production Development, Kyoto, Japan
- 杂志
- PLoS ONE（2019）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0216729
- 所属领域
- 代谢工程
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
探究植物ε-环化酶对非天然底物C50-番茄红素的底物耐受性，并构建C50-ε-胡萝卜素的生物合成途径。
研究策略
在E. coli中表达来自生菜的双端ε-环化酶(LsE)和拟南芥的单端ε-环化酶(AtE)，并通过RBS优化、N端截短突变以及调整培养条件（固体培养基）来提高目标产物产量。
核心内容
本研究在大肠杆菌中构建了C50-ε-胡萝卜素的生物合成途径，通过表达来自生菜的双端ε-环化酶LsE和拟南芥的单端ε-环化酶AtE，并结合RBS优化、N端截短突变及固体培养基培养策略来提升目标产物产量。结果显示LsE对C50-番茄红素完全无活性，而AtE则展现出弱但有效的催化能力，并意外地在C50底物背景下从单端环化酶转变为双端环化酶。通过N端截短40个氨基酸的AtE突变体AtE40d在TB琼脂板上培养48小时，C50-ε-胡萝卜素产量达到120 μg/g DCW，约为外源CrtY产生C50-β-胡萝卜素产量（约900 μg/g DCW）的13%。产物经鉴定为C50H68（m/z 668.5329），绝对构型为(6R,6'R)。研究还发现提高AtE的RBS强度或引入L448H突变均不能进一步增产。该工作首次实现了C50-ε-胡萝卜素的生物合成，揭示了植物ε-环化酶与细菌β-环化酶底物特异性的差异，并提出'尺子机制'模型解释底物识别，为扩展类胡萝卜素碳链长度和环化修饰提供了新的酶工程思路。
创新点
首次构建了C50-ε-胡萝卜素（C50-ε,ε-胡萝卜素）的生物合成途径；发现拟南芥AtE在C50背景下从单端环化酶转变为双端环化酶；提出'尺子机制'解释底物特异性。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | C50类胡萝卜素合成 | crtM | CrtM | 催化 | 突变体(F26A, W38A, F233S)，用于合成C50植物烯前体 |
| Escherichia coli | C50类胡萝卜素合成 | fds | Fds | 催化 | 突变体(Y81A,V157A)或(Y81M)，法尼基焦磷酸合酶，参与C50骨架构建 |
| Escherichia coli | C50类胡萝卜素合成 | crtI | CrtI | 催化 | 突变体N304P，八氢番茄红素脱氢酶，将C50植物烯转化为C50番茄红素 |
| Escherichia coli | C50类胡萝卜素合成 | crtY | CrtY | 催化 | 来自Pantoea ananatis的β-环化酶，作为对照，高效环化C50番茄红素 |
| Escherichia coli | C50类胡萝卜素合成 | LsE | LsE | 催化 | 来自生菜(Lactuca sativa)的双端ε-环化酶，对C50番茄红素无活性 |
| Escherichia coli | C50类胡萝卜素合成 | AtE | AtE | 催化 | 来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的单端ε-环化酶，对C50番茄红素有弱活性，在C50背景下作为双端环化酶 |
| Escherichia coli | C50类胡萝卜素合成 | AtE(L448H) | AtE(L448H) | 催化 | 已知可改变环化步数的突变体，但未提高C50产物产量 |
| Escherichia coli | C50类胡萝卜素合成 | AtE40d | AtE40d | 催化 | N端截短40个氨基酸的AtE突变体，在优化条件下产量达120 μg/g DCW |
关键发现
- LsE对C50-番茄红素完全无活性
- AtE可环化C50-番茄红素，产物分子量为668.5。通过N端截短40个氨基酸的AtE突变体(AtE40d)并在TB琼脂板上培养48小时，C50-ε-胡萝卜素产量达到120 μg/g DCW。对照实验中外源CrtY产生约900 μg/g DCW的C50-β-胡萝卜素，目标产物产量约为该值的13%（文中表述为ca. 20%）。产物经鉴定为C50H68（m/z 668.5329），绝对构型为(6R,6'R)。将AtE的RBS score从1274.52提高至18732.17未提高产量，L448H突变也无明显效果。
研究结论
植物ε-环化酶的底物特异性与细菌β-环化酶不同：LsE对C50-番茄红素具有严格的大小选择性，而AtE则表现出弱活性并意外地在C50背景下进行双端环化。通过蛋白质工程（N端截短）和培养条件优化，成功实现了C50-ε-胡萝卜素的中等产量合成，并提出了底物识别的'尺子机制'模型。