Comprehensive analysis of putative dihydroflavonol 4-reductase gene family in tea plant
- 作者
- Xin Mei, Caibi Zhou, Wenting Zhang, Dylan O'Neill Rothenberg, Shihua Wan, Lingyun Zhang
- 单位
- South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, Guangdong, China; College of Horticulture Science, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong, China; Department of Tea Science, Qiannan Normal University for Nationalities, Duyun, Guizhou, China
- 杂志
- PLoS ONE（2019）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0227225
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
茶树中除已鉴定的CsDFRa外，其余五个推定的二氢黄酮醇4-还原酶（CsDFRb1、CsDFRb2、CsDFRb3、CsDFRc、CsDFRd）的酶功能尚不明确，可能导致转录组分析误判；同时CsDFRa的底物特异性和稳定性及其关键氨基酸位点效应也不清楚。
研究策略
对6个推定的CsDFR基因进行生物信息学分析（序列、结构、启动子、系统发育），通过原核表达和蛋白纯化测定酶活性，结合定点突变（N141D、N141A）研究底物偏好，通过亚细胞定位和表达谱分析辅助判断。
核心内容
该研究对茶树中6个推定二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）基因进行了系统分析，旨在阐明其真实酶功能及CsDFRa的底物特异性和稳定性。通过生物信息学分析、大肠杆菌异源表达纯化、酶动力学测定以及定点突变（N141D、N141A），结合亚细胞定位和表达谱分析，研究发现仅CsDFRa具有催化活性，其余5个推定DFR均无功能，因此不应被纳入转录组分析中的DFR功能基因。CsDFRa对二氢槲皮素（DHQ）的Km为8.0 μM，催化效率约为对二氢杨梅素（DHM）的3倍；其最适pH约为7，最适温度35℃，在pH 4时活性残留不足10%。第141位天冬酰胺突变为天冬氨酸后，底物偏好倒转为对DHM效率约为DHQ的7倍，而突变为丙氨酸则使两种底物效率相近。CsDFRa定位于细胞质。这些结果明确了茶树类黄酮合成途径中功能性DFR的归属，并揭示了第141位氨基酸残基是调控底物偏好、进而影响儿茶素与花青素分支代谢流向的关键位点，为茶树黄酮组成改良提供了分子靶点。
创新点
首次系统比较茶树中6个推定DFR基因并证明只有CsDFRa具有催化活性；发现CsDFRa第141位天冬酰胺突变为天冬氨酸或丙氨酸后不改变对DHK的利用，但改变DHQ与DHM的偏好；揭示CsDFRa最适pH约为7、最适温度35℃，且不耐低pH和高温。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 Rosetta (DE3) | 黄酮类生物合成途径 | CsDFRa | 二氢黄酮醇4-还原酶 (DFR) | 催化 | 唯一有功能的DFR，异源表达并确认活性 |
| 大肠杆菌 Rosetta (DE3) | 黄酮类生物合成途径 | CsDFRb1 | 推定二氢黄酮醇4-还原酶 | 催化 | 未检测到催化活性 |
| 大肠杆菌 Rosetta (DE3) | 黄酮类生物合成途径 | CsDFRb2 | 推定二氢黄酮醇4-还原酶 | 催化 | 未检测到催化活性 |
| 大肠杆菌 Rosetta (DE3) | 黄酮类生物合成途径 | CsDFRb3 | 推定二氢黄酮醇4-还原酶 | 催化 | 未检测到催化活性 |
| 大肠杆菌 Rosetta (DE3) | 黄酮类生物合成途径 | CsDFRc | 推定蛋白（类似肉桂醇脱氢酶） | 催化 | 未检测到催化活性，可能非DFR |
| 大肠杆菌 Rosetta (DE3) | 黄酮类生物合成途径 | CsDFRd | 推定蛋白（类似短链脱氢酶/还原酶） | 催化 | 未检测到催化活性，可能非DFR |
| 大肠杆菌 Rosetta (DE3) | 黄酮类生物合成途径 | CsDFRaN141D | 突变体 DFR (N141D) | 催化 | 底物偏好改变，对DHM效率高于DHQ约7倍 |
| 大肠杆菌 Rosetta (DE3) | 黄酮类生物合成途径 | CsDFRaN141A | 突变体 DFR (N141A) | 催化 | 对DHQ和DHM效率相近，仍不能利用DHK |
| 拟南芥原生质体 | 黄酮类生物合成途径 | CsDFRa / CsDFRaΔ87 | 二氢黄酮醇4-还原酶 (DFR) | 催化 | 亚细胞定位显示位于细胞质 |
关键发现
- 只有CsDFRa能催化二氢黄酮醇底物，5个推定CsDFRs无活性
- CsDFRa对DHQ的Km为8.0 μM，对DHM为43.0 μM，催化效率（Kcat/Km）对DHQ为1718.2 L/kg*s，约为DHM（601.7）的3倍
- DHQ产物A520=0.693±0.031，DHK产物A520=0.038±0.010
- N141D突变使对DHM效率（1344.1）比DHQ（195.8）高约7倍
- N141A突变对DHQ和DHM效率相近（829.2和797.4）
- CsDFRa在pH4时剩余活性<10%，45℃时不稳定
- CsDFRa定位在细胞质。
研究结论
研究表明在茶树类黄酮生成花青素和儿茶素的途径中，只有CsDFRa是功能性DFR，其余五个推定DFR不应纳入转录组分析的DFR功能基因；CsDFRa的N141位点可影响底物偏好，为未来改良茶树黄酮组成提供思路。