Heterologous expression of 2-methylisoborneol / 2 methylenebornane biosynthesis genes in Escherichia coli yields novel C11-terpenes
- 作者
- Max J. Kschowak, Hannah Wortmann, Jeroen S. Dickschat, Jens Schrader, Markus Buchhaupt
- 单位
- DECHEMA Research Institute, Industrial Biotechnology, Frankfurt am Main, Germany; Faculty of Biological Sciences, Goethe University, Frankfurt am Main, Germany; Kekulé-Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Rheinische Friedrich Wilhelms University, Bonn, Germany
- 杂志
- PLoS ONE（2018）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0196082
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探索细菌2-甲基异莰醇/2-亚甲基莰烷合酶在大肠杆菌中异源表达后能否产生新型C11-萜类化合物，并拓展萜类结构多样性（突破异戊二烯规则）。
研究策略
在大肠杆菌中异源共表达甲羟戊酸途径、IPP异构酶、GPP合酶、GPP甲基转移酶及四种不同的C11-萜烯合酶，实现C11-萜的从头合成，并通过HS-SPME/GC-MS和SBSE/GC-MS分析产物。
核心内容
本研究在大肠杆菌MG1655 ΔendA ΔrecA (DE3)中异源共表达甲羟戊酸途径、IPP异构酶、GPP合酶、GPP甲基转移酶及四种来源不同的C11-萜烯合酶（两种2-亚甲基莰烷合酶和两种2-甲基异莰醇合酶），以探索非典型C11-萜类化合物的生物合成可能。通过HS-SPME/GC-MS和SBSE/GC-MS分析，从四种生产菌株中共鉴定出35种C11-萜类产物，其中24种为新型结构，包括3,4-二甲基异丙苯、2-甲基龙脑以及2-甲基香茅醇的两种非对映异构体等四种此前未报道的化合物。2-甲基异莰醇和2-亚甲基莰烷在各菌株中均为主要产物。此外，表达GPP甲基转移酶的菌株可产生C16萜6-甲基法尼醇，而缺失该酶的对照菌株不产此物，表明其由内源FPP合酶催化2-甲基GPP与IPP缩合生成6-甲基FPP后去磷酸化形成。该研究首次在大肠杆菌中实现多种C11-萜的从头合成，拓展了萜类结构多样性，突破了经典异戊二烯规则的限制，并为6-甲基FPP的细胞内合成提供了新途径。
创新点
首次通过异源表达GPP甲基转移酶与C11-萜烯合酶在大肠杆菌中从头生产35种C11-萜，其中24种为新型C11-萜；鉴定出4种全新化合物（3,4-二甲基异丙苯、2-甲基龙脑及2-甲基香茅醇两种非对映异构体）；发现GPP甲基转移酶表达菌株可产生C16萜6-甲基法尼醇。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 ΔendA ΔrecA (DE3) | 甲羟戊酸途径 | atoB, mvaS, mvaA, ERG12, ERG8, MVD1 | — | 催化 | 提供IPP和DMAPP前体 |
| Escherichia coli MG1655 ΔendA ΔrecA (DE3) | 萜类合成 | idi | IPP异构酶 | 催化 | IPP与DMAPP互变 |
| Escherichia coli MG1655 ΔendA ΔrecA (DE3) | 萜类合成 | trGPPS2 | GPP合酶 | 催化 | 合成GPP |
| Escherichia coli MG1655 ΔendA ΔrecA (DE3) | 非经典萜类合成 | gppmtase | GPP甲基转移酶 (NP_631739.1) | 催化 | 将GPP甲基化为2-甲基GPP |
| Escherichia coli MG1655 ΔendA ΔrecA (DE3) | C11-萜合成 | mbsp | 2-亚甲基莰烷合酶 MBSp (WP_011333305.1) | 催化 | 来自Pseudomonas fluorescens Pf0-1，以2-甲基GPP为底物 |
| Escherichia coli MG1655 ΔendA ΔrecA (DE3) | C11-萜合成 | mbsm | 2-亚甲基莰烷合酶 MBSm (BAK26793.1) | 催化 | 来自Micromonospora olivasterospora |
| Escherichia coli MG1655 ΔendA ΔrecA (DE3) | C11-萜合成 | mibsg | 2-甲基异莰醇合酶 MIBsg (WP_012378420.1) | 催化 | 来自Streptomyces griseus subsp. griseus |
| Escherichia coli MG1655 ΔendA ΔrecA (DE3) | C11-萜合成 | mibsc | 2-甲基异莰醇合酶 MIBSc (NP_733742.1) | 催化 | 来自Streptomyces coelicolor A3(2) |
| Escherichia coli MG1655 ΔendA ΔrecA (DE3) | 萜类合成 | ispA | FPP合酶 | 催化 | 内源FPP合酶，催化2-甲基GPP与IPP缩合生成6-甲基FPP |
| Escherichia coli MG1655 ΔendA ΔrecA (DE3) | 萜类产物去磷酸化 | pgpB, ybjG | PgpB, YbjG磷酸酶 | 催化 | 推测参与6-甲基FPP去磷酸化生成6-甲基法尼醇 |
| Escherichia coli MG1655 ΔendA ΔrecA (DE3) | 单萜形成 | — | — | 催化 | 内源酶如YjbB将香叶醇转化为橙花醇、香叶醛和橙花醛，导致非酶促单萜形成 |
关键发现
- 通过HS-SPME GC-MS和SBSE GC-MS分析，从四种生产菌株（11-p、11-m、11-g、11-c）共鉴定出35种C11-萜烯，包括11种已知化合物和24种新型C11-萜
- 其中新鉴定的化合物为3,4-二甲基异丙苯、2-甲基龙脑和2-甲基香茅醇的两种非对映异构体。检测到29种单萜及5种倍半萜（橙花叔醇、2,3-二氢法尼醇、(Z,E)-法尼醇、(E,E)-法尼醇、法尼醛）。表达GPP甲基转移酶的菌株（包括对照11-0）产生C16萜6-甲基法尼醇，而缺少GPP甲基转移酶的10-0菌株不产生该化合物，表明6-甲基法尼醇由内源FPP合酶催化2-甲基GPP与IPP缩合生成6-甲基FPP后去磷酸化形成。2-甲基异莰醇和2-亚甲基莰烷在四种生产菌株中均为主要产物。
研究结论
本研究证明在大肠杆菌中表达GPP甲基转移酶和C11-萜烯合酶可获得广泛的非典型C11-萜类化合物，并揭示了C11-萜烯合酶的新机制；同时提供了6-甲基FPP的细胞合成途径。