Unraveling the Triterpenoid Saponin Biosynthesis of the African Shrub Maesa lanceolata
- 作者
- Tessa Moses, Jacob Pollier, Ahmad Faizal, Sandra Apers, Luc Pieters, Johan M. Thevelein, Danny Geelen, Alain Goossens
- 单位
- VIB Department of Plant Systems Biology, Technologiepark 927, B-9052 Gent, Belgium; Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent University, Technologiepark 927, B-9052 Gent, Belgium; Department of Molecular Microbiology, VIB, Kasteelpark Arenberg 31, B-3001 Leuven-Heverlee, Belgium; Laboratory of Molecular Cell Biology, Institute of Botany and Microbiology, KU Leuven, Kasteelpark Arenberg 31, B-3001 Leuven-Heverlee, Belgium; Department of Plant Production, Faculty of Bioscience Engineering, Ghent University, Coupure Links 653, 9000 Ghent, Belgium; Laboratory of Pharmacognosy and Pharmaceutical Analysis, Department of Pharmaceutical Sciences, University of Antwerp, Universiteitsplein 1, B-2610 Antwerp, Belgium
- 杂志
- Molecular Plant（2015）
- DOI
- 10.1016/j.molp.2014.11.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析非洲灌木Maesa lanceolata中三萜皂苷（maesasaponins）的生物合成途径，鉴定参与β-amyrin骨架修饰的关键酶基因，为异源生产提供依据。
研究策略
结合茉莉酸甲酯（MeJA）诱导的cDNA-AFLP转录组分析筛选候选基因，通过工程化酵母异源表达进行功能筛选，并结合转基因M. lanceolata植株的过表达/沉默验证及苜蓿毛状根突变体互补实验确认基因功能。
核心内容
该研究通过结合茉莉酸甲酯诱导的cDNA-AFLP转录组分析和酵母异源表达，解析了非洲灌木Maesa lanceolata中三萜皂苷maesasaponins的生物合成途径，鉴定了三个关键酶基因。β-amyrin合酶MlbAS在酵母中仅产生痕量产物，而对照酶分别积累36 mg/l和19 mg/l，提示其催化效率较低或存在翻译后调控。CYP716A75催化β-amyrin连续氧化生成erythroidol、oleanolic aldehyde和oleanolic acid，产物比例为8.7:1.1:0.2；CYP87D16则催化C-16α羟基化生成16α-羟基-β-amyrin，二者组合表达可产生多种双修饰中间体。转基因验证表明，CYP716A75能互补苜蓿Iha-1突变体恢复溶血性皂苷积累，而MlbAS过表达导致植株矮化但皂苷含量增加，沉默则降低含量。这些结果阐明了β-amyrin经C-28和C-16α氧化生成皂苷元中间体的完整路径，为maesasaponins的异源生产奠定基础，并揭示了C-16α氧化活性在不同植物谱系P450家族中独立进化的现象。
创新点
首次鉴定了maesasaponin生物合成中的三个关键酶：β-amyrin合酶（MlbAS）、C-28氧化酶CYP716A75和C-16α氧化酶CYP87D16；发现CYP87D16属于非A型CYP85家族，与已知C-16α氧化酶CYP716Y1无同家族关系，提示C-16α氧化活性在不同植物谱系中独立进化。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜皂苷生物合成 | MlbAS | β-amyrin synthase | 催化 | 催化2,3-氧化鲨烯环化生成β-amyrin；在酵母TM1菌株中异源表达活性较低，仅检测到微量产物 |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜皂苷生物合成 | CYP716A75 | 细胞色素P450 CYP716A75 | 催化 | β-amyrin C-28氧化酶，催化三步氧化生成erythroidol、oleanolic aldehyde和oleanolic acid；在酵母中产物比例8.7:1.1:0.2 |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜皂苷生物合成 | CYP87D16 | 细胞色素P450 CYP87D16 | 催化 | β-amyrin C-16α氧化酶，催化生成16α-羟基-β-amyrin |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜皂苷生物合成 | CYP87D16 / CYP716A75 | 细胞色素P450 CYP87D16和CYP716A75 | 催化 | 通过2A肽共表达两个P450，生成16α-羟基-erythroidol、16α-羟基-oleanolic aldehyde和echinocystic acid等maesasaponin中间体 |
| Medicago truncatula | 三萜皂苷生物合成 | CYP716A75 | 细胞色素P450 CYP716A75 | 催化 | 在Iha-1（cyp716a12突变体）毛状根中异源表达，恢复C-28氧化酶活性并积累溶血性皂苷，但水平低于CYP716A12互补系 |
| Maesa lanceolata | 三萜皂苷生物合成 | MlbAS | β-amyrin synthase | 催化 | 过表达MlbAS增加maesasaponins积累并伴随矮化表型；hairpin RNAi沉默降低maesasaponins含量 |
关键发现
- MlbAS在酵母TM1中异源表达仅产生痕量β-amyrin，而对照G. glabra bAS和M. truncatula bAS分别积累36 mg/l和19 mg/l
- CYP716A75催化β-amyrin生成erythroidol、oleanolic aldehyde和oleanolic acid，比例为8.7:1.1:0.2，而CYP716A12对应比例为6.5:2.4:1.1
- CYP87D16催化β-amyrin的C-16α羟基化生成16α-羟基-β-amyrin
- 组合表达CYP87D16与CYP716A75可生成16α-羟基-erythroidol、16α-羟基-oleanolic aldehyde和echinocystic acid三个中间体
- CYP716A75表达可互补M. truncatula Iha-1突变体，恢复溶血性皂苷积累
- MlbAS过表达导致植株矮化、叶片黄化，且maesasaponins积累增加，而MlbAS沉默则降低maesasaponins含量。
研究结论
本研究鉴定了M. lanceolata中maesasaponin生物合成的三个关键酶，阐明了β-amyrin经C-28氧化和C-16α氧化生成多种皂苷元中间体的路径，为通过合成生物学方法异源生产maesasaponins奠定了基础，并揭示了C-16α氧化酶在不同P450家族中独立进化的现象。