A Genome-wide Scenario of Terpene Pathways in Self-pollinated Artemisia annua L
- 作者
- Dong-Ming Ma, Zhilong Wang, Liangjiang Wang, Fatima Alejos-Gonzales, Ming-An Sun, De-Yu Xie
- 单位
- Department of Plant and Microbial Biology, North Carolina State University; Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University; Virginia Bioinformatics Institute, Virginia Polytechnic Institute and State University; Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Utilization, Hunan Agricultural University
- 杂志
- Molecular Plant（2015）
- DOI
- 10.1016/j.molp.2015.07.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
自花授粉青蒿（Artemisia annua L.）中萜类生物合成途径的基因-代谢物全景尚不清楚，青蒿素产量受复杂萜类网络影响且难以稳定提高。
研究策略
以自花授粉F3代青蒿为材料，利用GC-MS/LC-ESI-MS代谢组学分析14个组织的非极性代谢物，结合454焦磷酸测序获得6个组织的转录组，并对47个萜类相关基因进行表达分析，通过Pearson相关分析整合基因表达与代谢物积累网络；再利用ADS过表达和RNAi转基因植株验证ADS在青蒿素和其他萜类合成中的关键作用。
核心内容
该研究以自花授粉青蒿F3代为材料，系统绘制了萜类生物合成的全基因组图谱。作者对14个组织进行GC-MS/LC-ESI-MS代谢组学分析，鉴定出88种非极性代谢物，包括22种倍半萜、26种单萜和3种三萜；同时通过454焦磷酸测序获得6个组织的转录组，组装出18,871个contigs，并注释了47个参与青蒿素及萜类前体途径的基因。表达分析显示，青蒿素含量在花蕾中最高，约为0.3%干重，ADS基因在该组织中的RPKM值达324。通过ADS过表达和RNAi双向操作，证实ADS不仅控制青蒿素分支（过表达使青蒿素、青蒿酸和arteannuin b显著增加），还影响β-法尼烯、石竹烯等非青蒿素倍半萜的积累。Pearson相关分析进一步构建了含34个基因和22种代谢物的显著共表达网络。该研究首次在自花授粉青蒿中建立基因-萜类途径全景图，明确ADS是青蒿素分支与非青蒿素分支间的核心调控节点，为青蒿素代谢工程改良提供了重要靶点和资源。
创新点
首次在自花授粉青蒿中建立全基因组尺度的基因-萜类途径网络图；发现CPR2等新同源基因的组织特异性表达；通过ADS的过表达和RNAi双向操作，证明ADS不仅控制青蒿素分支，还影响非青蒿素倍半萜和全局挥发性代谢谱。
研究对象（40）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 青蒿素生物合成 | ADS | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 催化FPP环化为amorphadiene，是青蒿素途径第一步；RPKM在HB最高（324）；过表达增加青蒿素、青蒿酸和arteannuin b，RNAi降低。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 青蒿素生物合成 | CYP71AV1 | cytochrome P450 monooxygenase | 催化 | 催化amorphadiene氧化；RPKM在50%OH最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 青蒿素生物合成 | CPR1 | cytochrome P450 reductase | 催化 | 与CYP71AV1形成氧化还原伴侣；RPKM在L7最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 青蒿素生物合成 | CPR2 | cytochrome P450 reductase | 催化 | 主要在花组织表达，RPKM在50%OH最高；可能参与花中青蒿酸合成。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 青蒿素生物合成 | DBR2 | artemisinic aldehyde Δ11(13) double bond reductase | 催化 | 催化青蒿醛还原；RPKM在L7最高，但RT-PCR显示花组织表达更高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 青蒿素生物合成 | ALDH1 | aldehyde dehydrogenase 1 | 催化 | 催化青蒿醛氧化为青蒿酸；RPKM在HB最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 青蒿素生物合成 | ADH1 | alcohol dehydrogenase | 催化 | 从序列中鉴定出29个同源contig；参与青蒿酸合成。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 青蒿素生物合成 | CYB5 | cytochrome b5 | 催化 | 鉴定了15个同源contig；与CYP71AV1和CPR协作。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 萜类前体合成（FPP供给） | FDS1 | farnesyl diphosphate synthase 1 | 催化 | 催化IPP/DMAPP合成FPP；RPKM在50%OH最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 萜类前体合成（FPP供给） | FDS2 | farnesyl diphosphate synthase 2 | 催化 | 与FDS1同源；RPKM在50%OH最高；与β-法尼烯、石竹烯等显著正相关。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 非青蒿素倍半萜生物合成 | AaGAS | germacrene A synthase | 催化 | 催化FPP生成germacrene A；RPKM在HB最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 非青蒿素倍半萜生物合成 | AaCPS | β-caryophyllene synthase | 催化 | 催化FPP生成β-石竹烯；RPKM在HB最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 非青蒿素倍半萜生物合成 | AaECS | 8-epi-cedrol synthase | 催化 | 催化FPP生成8-epi-cedrol；RPKM在L15最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 非青蒿素倍半萜生物合成 | unknown SQTS | 未知倍半萜合酶 | 催化 | 与AaECS和AaGAS分别有72%和74%同一性；RPKM在50%OH最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 三萜生物合成 | AaSQS | squalene synthase | 催化 | 催化两分子FPP合成角鲨烯；RPKM在L7最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 三萜生物合成 | AaBAS | β-amyrin synthase | 催化 | 通过RT-PCR检测到在14个组织中表达；催化角鲨烯环化生成β-香树脂醇。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 非青蒿素倍半萜生物合成 | AaBFS | β-farnesene synthase | 催化 | 通过RT-PCR检测到在14个组织中表达；催化FPP生成β-法尼烯。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 单萜生物合成 | AaLS | limonene synthase | 催化 | 催化GPP生成柠檬烯；RPKM在L7高于L15。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 单萜生物合成 | AaCIN | 1,8-cineole synthase | 催化 | 催化GPP生成1,8-桉叶素；RPKM在50%OH最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 单萜生物合成 | AaBPS | β-pinene synthase | 催化 | 催化GPP生成β-蒎烯；RPKM在IB15和50%OH较高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 单萜生物合成 | AaLAS1 | linalool synthase 1 | 催化 | 催化GPP生成芳樟醇；RPKM在50%OH最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 单萜生物合成 | AaLAS2 | linalool synthase 2 | 催化 | 催化GPP生成芳樟醇；RPKM在HB最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 单萜生物合成 | AaLAS3 | linalool synthase 3 | 催化 | 催化GPP生成芳樟醇；RPKM在L7最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 单萜生物合成 | AaLAS4 | linalool synthase 4 | 催化 | 催化GPP生成芳樟醇；RPKM在L7最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | 单萜生物合成 | AaLAS5 | linalool synthase 5 | 催化 | 催化GPP生成芳樟醇；RPKM在50%OH最高；与芳樟醇积累正相关。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaDXS1 | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | 代表DXS1/2/3同源组；RPKM在50%OH最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaDXS4 | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | RPKM在50%OH最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaDXS5 | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | RPKM在HB最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaDXS6 | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | RPKM在L7高于IB15和50%OH。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaDXR1 | 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase | 催化 | RPKM在L7最高；14个组织中表达水平相似。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaDXR2 | 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase | 催化 | RPKM在50%OH最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaMCT | 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidyltransferase | 催化 | RPKM在50%OH最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaCMK | 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase | 催化 | RPKM在FOH最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaMDS | 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase | 催化 | RPKM在L7最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaHDS | 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-diphosphate synthase | 催化 | RPKM在L7最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaHDR1 | 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase | 催化 | RPKM在FOH最高；14个组织均有表达。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaHDR2 | 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase | 催化 | RPKM在50%OH最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaIPPI1 | isopentenyl pyrophosphate isomerase | 催化 | RPKM在50%OH最高；14个组织表达水平相似。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MEP途径 | AaIPPI2 | isopentenyl pyrophosphate isomerase | 催化 | RPKM在HB最高。 |
| Artemisia annua L.（自花授粉F3/F6代） | MVA途径 | AaAACT1 | acetoacetyl-CoA thiolase | 催化 | RPKM在FOH最高。 |
关键发现
- 从14个组织中鉴定出88种代谢物，包括22种倍半萜（含青蒿素）、26种单萜、3种三萜和38种其他非极性代谢物
- 转录组测序获得1,133,865条高质量reads，组装成18,871个contigs，约95%获得功能注释
- 鉴定47个基因涉及青蒿素、非青蒿素倍半萜、单萜、三萜、MEP和MVA途径
- 青蒿素含量在花蕾（HB）中最高，约0.03%（g/g鲜重，相当于0.3%干重）
- ADS的RPKM在HB中最高（324），其次为50%OH（160）、FOH（176）和IB15（89）
- 非青蒿素倍半萜合酶（GAS+CPS+ECS+unknown SQTS）的RPKM总和在HB、50%OH、FOH、IB15中分别约为518、691、357、91
- ADS过表达使青蒿素、青蒿酸和arteannuin b含量显著增加（如ADS-GFP-1、-2、-3等系），RNAi则显著降低
- ADS过表达还降低β-法尼烯、石竹烯和可巴烯含量，RNAi则增加石竹烯和可巴烯含量
- Pearson相关分析显示34个基因与22个萜类代谢物形成显著相关网络（r>0.9或r<-0.9，p<0.05）。
研究结论
自花授粉青蒿中萜类合成途径呈组织特异性和发育阶段性调控，ADS是青蒿素分支与非青蒿素倍半萜分支之间的关键调控节点；该基因-萜类图谱为青蒿素的代谢工程改良提供了重要基础。