SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana
- 作者
- Hieng-Ming Ting, Thierry L. Delatte, Pim Kolkman, Johana C. Misas-Villamil, Renier A.L. van der Hoorn, Harro J. Bouwmeester, Alexander R. van der Krol
- 单位
- Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University; Plant Chemetics Laboratory, Max Planck Institute for Plant Breeding Research; Plant Chemetics laboratory, Department of Plant Sciences, University of Oxford
- 杂志
- MOLECULAR PLANT（2015）
- DOI
- 10.1016/j.molp.2015.01.006
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究囊泡融合在植物萜烯类物质细胞内转运及释放中的作用，以及抑制VAMP72介导的囊泡融合对异源萜烯合酶在烟草中合成与释放萜烯的影响。
研究策略
利用农杆菌介导的瞬时表达体系，在本氏烟草中共表达石竹烯合酶(CST)或芳樟醇合酶(FaNES)与MtVAMP721e-RNAi，通过顶空GC-MS测定萜烯释放量；结合RNA-seq、qRT-PCR、DsRed荧光定量、泛素化蛋白免疫印迹和蛋白酶体活性测定，分析转录组和蛋白质稳态变化。
研究路线图
核心内容
本研究在本氏烟草中利用农杆菌瞬时表达体系，共表达异源石竹烯合酶（CST）或芳樟醇合酶（FaNES）与MtVAMP721e-RNAi（Vi）以抑制VAMP72介导的囊泡融合，通过顶空GC-MS测定萜烯释放量，并结合RNA-seq、qRT-PCR、泛素化蛋白免疫印迹及蛋白酶体活性测定分析机制。结果显示，Vi共表达使石竹烯释放量较对照提高约5倍，芳樟醇释放量提高约8倍，同时VAMP72c mRNA水平降低近9倍；RNA-seq揭示CST与Vi共表达协调上调26S蛋白酶体14个核心颗粒、6个盖子及7个底座亚基基因，叶片泛素化蛋白水平较对照高1.8倍，但石竹烯和芳樟醇在100 μM浓度下均不直接抑制体外20S蛋白酶体活性。研究表明抑制囊泡融合可显著提升异源萜烯产量，机制可能与26S蛋白酶体功能受损致萜烯合成途径蛋白半衰期延长有关，为通过调控蛋白降解提高植物萜烯产量提供了代谢工程新思路。
创新点
['首次发现抑制VAMP72介导的囊泡融合可使异源表达石竹烯合酶和芳樟醇合酶的萜烯释放量显著提高（约5倍和8倍）；', '揭示了CST+Vi共表达诱导26S蛋白酶体相关基因协调上调、泛素化蛋白水平升高，提示蛋白降解减弱可能参与萜烯产量的提高；', '证明石竹烯和芳樟醇在体外(浓度达100 μM)不直接抑制20S蛋白酶体活性。']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 倍半萜生物合成 | At5g23960 (CST/TPS21) | 石竹烯合酶 (CST) | 催化 | 拟南芥来源，采用CaMV35S启动子瞬时表达，催化法尼基焦磷酸生成石竹烯 |
| Nicotiana benthamiana | 单萜生物合成 | FaNES | 芳樟醇/橙花叔醇合酶 | 催化 | 草莓来源，带质体靶信号，催化生成芳樟醇 |
| Nicotiana benthamiana | 囊泡运输/胞吐 | MtVAMP721e-RNAi (Vi) | MtVAMP721e (v-SNARE) | 转运 | RNAi下调本氏烟草多个VAMP72基因，抑制囊泡与质膜融合 |
| Nicotiana benthamiana | 囊泡运输/胞吐 | NbVAMP72基因家族（14个成员） | VAMP72蛋白 | 转运 | 其中10个成员在Vi处理中表达下调；与MtVAMP721e序列同一性67-83% |
| Nicotiana benthamiana | 蛋白降解/26S蛋白酶体 | 26S蛋白酶体核心(14/14)、盖子(6/9)和底座(7/9)亚基基因 | 26S蛋白酶体 | 调控 | C+Vi处理中这些基因协调上调，但提取物蛋白酶体活性未降低 |
| Nicotiana benthamiana | 萜烯前体代谢 | HMGS、HMGR、IDI、MCS、HDS、FDS | — | 催化 | MVA和MEP途径及法尼基焦磷酸合酶基因在C+Vi处理中表达下调 |
关键发现
- ['在本氏烟草中共表达CST与MtVAMP721e-RNAi使石竹烯释放量较CST+Di提高约5倍
- ', 'FaNES与MtVAMP721e-RNAi共表达使芳樟醇释放量提高约8倍
- ', 'MtVAMP721e-RNAi使本氏烟草VAMP72c mRNA水平降低近9倍
- ', '本氏烟草基因组含14个VAMP72基因，与MtVAMP721e DNA序列同一性67-83%
- RNA-seq显示其中10个VAMP72基因的表达在Vi处理中下调
- ', 'RNA-seq显示C+Vi处理较对照上调1822个基因、下调1353个基因，特异性响应为1400个上调、1192个下调
- Vi+Di为144个上调、214个下调
- C+Di为619个上调、769个下调
- ', 'C+Vi处理协调上调26S蛋白酶体组分：14/14核心颗粒、6/9盖子、7/9底座亚基基因
- ', 'C+Vi叶片中DsRed蛋白信号平均增加约25%，叶绿素信号降低约10%
- ', 'C+Vi叶片蛋白提取物中泛素化蛋白水平比C+Di高1.8倍
- ', '石竹烯和芳樟醇在100 μM浓度下均不抑制体外20S蛋白酶体活性。']
研究结论
抑制VAMP72介导的囊泡融合与异源萜烯合酶共表达可显著提高石竹烯和芳樟醇的释放量，机制可能与26S蛋白酶体功能受损、萜烯合成途径蛋白半衰期延长有关；实验未能直接证明囊泡融合参与萜烯转运，但结果为通过调控蛋白降解提高植物萜烯产量提供了代谢工程新思路。