Characterizations of Panax ginseng UDP- glycosyltransferases catalyzing protopanaxatriol and biosyntheses of bioactive ginsenosides F1 and Rh1 in metabolically engineered yeasts
- 作者
- Wei Wei, Pingping Wang, Yongjun Wei, Qunfang Liu, Chengshuai Yang, Guoping Zhao, Jianmin Yue, Xing Yan, Zhihua Zhou
- 单位
- 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，CAS-合成生物学重点实验室，上海 200032，中国；中国科学院上海生命科学研究院药物研究所，新药研究国家重点实验室，上海 201203，中国
- 杂志
- Molecular Plant（2015）
- DOI
- 10.1016/j.molp.2015.05.010
- 所属领域
- 代谢工程与合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
人参皂苷是人参的主要药理活性天然化合物，多为原人参二醇(PPD)和原人参三醇(PPT)的糖基化产物；此前尚未有催化PPT生成PPT型人参皂苷的UDP-糖基转移酶(UGT)的报道。
研究策略
从人参中克隆新的UGT基因并在大肠杆菌中异源表达，通过体外酶活分析、结构建模和定点突变解析其催化活性和区域选择性；将PPT合成途径与关键UGT导入酿酒酵母，构建产人参皂苷F1和Rh1的细胞工厂。
核心内容
本研究从人参中克隆了四个新的UDP-糖基转移酶基因UGTPg1、UGTPg100、UGTPg101和UGTPg103，并在大肠杆菌中异源表达后对其催化功能进行了系统表征。体外酶活分析显示，UGTPg1特异性催化原人参三醇C20-OH糖基化生成人参皂苷F1，而UGTPg100特异性催化C6-OH糖基化生成Rh1，UGTPg101则能顺序催化生成F1和Rg1。对UGTPg1和UGTPg100的酶动力学分析显示其Vmax分别为386和426 nmol/min/mg。通过定点突变，鉴定了决定催化活性和区域选择性的关键氨基酸残基，如H144对UGTPg1的C20-OH活性至关重要，A142、L186和G338对UGTPg100的C6-OH活性至关重要。进一步将PPT合成途径与关键UGT导入酿酒酵母，构建了产人参皂苷的细胞工厂，其中菌株ZW-F1-17产F1达42.1 mg/L，菌株ZW-Rh1-20产Rh1达92.8 mg/L。该研究首次报道了催化PPT糖基化的UGT，揭示了PPT型人参皂苷的生物合成途径，并通过合成生物学策略实现了高价值人参皂苷F1和Rh1的微生物发酵生产，为工业化生产奠定了基础。
创新点
首次报道催化PPT糖基化的UGT：UGTPg100特异性催化C6-OH生成Rh1，UGTPg101顺序催化生成F1和Rg1；通过定点突变鉴定了决定活性与区域选择性的关键氨基酸残基；在工程酵母中实现了生物活性人参皂苷F1和Rh1的从头合成。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | 人参皂苷生物合成 | UGTPg1 | UGTPg1 (UDP-糖基转移酶) | 催化 | 重组表达后催化PPT C20-OH糖基化生成F1；对PPT的Vmax=386±14 nmol/min/mg，Km=104±12 μM |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | 人参皂苷生物合成 | UGTPg100 | UGTPg100 (UDP-糖基转移酶) | 催化 | 特异性催化PPT C6-OH糖基化生成Rh1，也能催化F1生成Rg1；对PPT的Vmax=426±20 nmol/min/mg，Km=153±10 μM |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | 人参皂苷生物合成 | UGTPg101 | UGTPg101 (UDP-糖基转移酶) | 催化 | 顺序催化PPT C20-OH生成F1，再催化F1 C6-OH生成Rg1 |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | 人参皂苷生物合成 | UGTPg102 | UGTPg102 (UDP-糖基转移酶) | 催化 | 与UGTPg1有95.4%氨基酸一致性，但未检测到对PPT/PPD及其皂苷的催化活性 |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | 人参皂苷生物合成 | UGTPg103 | UGTPg103 (UDP-糖基转移酶) | 催化 | 与UGTPg100有98.7%氨基酸一致性，但未检测到催化活性 |
| 酿酒酵母 (ZW-F1-17) | 人参皂苷生物合成 | UGTPg1 | UGTPg1 | 催化 | 与PPT合成途径共表达，实现F1从头合成，产量42.1 mg/L |
| 酿酒酵母 (ZW-Rh1-20) | 人参皂苷生物合成 | UGTPg100 | UGTPg100 | 催化 | 与PPT合成途径共表达，实现Rh1从头合成，产量92.8 mg/L |
| 酿酒酵母 | 三萜/人参皂苷前体生物合成 | PgDDS | 达玛烯二醇-II合酶 | 催化 | 催化2,3-氧化鲨烯环化生成达玛烯二醇-II (DM) |
| 酿酒酵母 | 人参皂苷生物合成 | CYP716A47 | 细胞色素P450 716A47 | 催化 | 催化DM C12位羟基化生成原人参二醇 (PPD) |
| 酿酒酵母 | 人参皂苷生物合成 | CYP716A53v2 | 细胞色素P450 716A53v2 | 催化 | 催化PPD C6位羟基化生成原人参三醇 (PPT) |
| 酿酒酵母 | 人参皂苷生物合成 | PgCPR1 | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 为CYP716A47和CYP716A53v2提供电子，为P450催化供应还原力 |
关键发现
- 克隆并鉴定了4个新的人参UGT基因UGTPg100、UGTPg101、UGTPg102和UGTPg103。UGTPg1可特异性糖基化PPT的C20-OH生成F1
- UGTPg100特异性糖基化PPT的C6-OH生成Rh1，还可将F1转化为Rg1
- UGTPg101可顺序催化PPT生成F1和Rg1
- UGTPg102和UGTPg103未检测到活性。UGTPg1对PPT的Vmax为386±14 nmol/min/mg，Km为104±12 μM，kcat为17.9 s^-1，kcat/Km为0.17 μM^-1 s^-1
- UGTPg100对PPT的Vmax为426±20 nmol/min/mg，Km为153±10 μM，kcat为9.1 s^-1，kcat/Km为0.06 μM^-1 s^-1。定点突变表明H144对UGTPg1的C20-OH活性至关重要，A142、L186和G338对UGTPg100的C6-OH活性至关重要，H82C和H144F突变改变区域选择性。在工程酵母中，菌株ZW-F1-17产F1达42.1 mg/L，菌株ZW-Rh1-20产Rh1达92.8 mg/L。
研究结论
本研究揭示了人参中PPT型人参皂苷可能的生物合成途径，并通过合成生物学策略在酿酒酵母中成功实现了生物活性人参皂苷F1和Rh1的生产，为通过微生物发酵工业化生产这两种高价值天然化合物奠定了基础。