Compartmentalized Metabolic Engineering for Artemisinin Biosynthesis and Effective Malaria Treatment by Oral Delivery of Plant Cells
- 作者
- Karan Malhotra, Mayavan Subramaniyan, Khushboo Rawat, Md. Kalamuddin, M. Irfan Qureshi, Pawan Malhotra, Asif Mommed, Katrina Cornish, Henry Daniell, Shashi Kumar
- 单位
- Metabolic Engineering Group; Malaria Research Group; International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110067, India; Department of Biotechnology, Jamia Millia Islamia, New Delhi 110025, India; Department of Horticulture and Crop Science, The Ohio State University, Wooster, OH 44691, USA; Department of Biochemistry, School of Dental Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA 19104, USA
- 杂志
- Molecular Plant（2016）
- DOI
- 10.1016/j.molp.2016.09.013
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
青蒿素生产成本高，提取和纯化过程昂贵，需要开发在可食用植物中完整生物合成青蒿素并通过口服递送实现有效抗疟治疗的替代方案。
研究策略
将酵母甲羟戊酸（MEV）途径整合到烟草叶绿体基因组以增加IPP前体供应，同时将青蒿素生物合成途径（ADS、CYP71AV1、AACPR、DBR2、IDI、FPP）整合到核基因组，并通过亚细胞靶向信号（叶绿体转运肽和线粒体cox4信号肽）实现基因在叶绿体、线粒体和细胞质的区室化表达，最终在双转基因烟草中完成青蒿素全合成，并利用口服植物细胞递送验证抗疟效果。
核心内容
该研究通过区室化代谢工程策略，在烟草中实现了青蒿素的完整生物合成，并验证了口服植物细胞递送青蒿素的抗疟疗效。研究者将酵母甲羟戊酸途径整合至烟草叶绿体基因组以增加IPP前体供应，同时将青蒿素合成途径相关基因整合至核基因组，借助叶绿体转运肽和线粒体cox4信号肽实现途径酶在叶绿体、线粒体和细胞质中的区室化表达。其中，AACPR、DBR2、CYP71AV1被靶向叶绿体，利用无糖基化的细胞器环境避免产物修饰，ADS则靶向线粒体以利用其中丰富的FPP池。双转基因烟草中青蒿素含量最高达0.8 mg/g干重（877±40 μg/g），较此前报道的6.8 μg/g大幅提升，IPP/DMAPP总量较野生型提高约3倍。其部分纯化提取物对恶性疟原虫的IC50约为79 nM，口服干燥叶片的小鼠寄生虫血症从约2.5%降至约1.6%，效果优于纯青蒿素。该工作证明区室化表达可支撑复杂天然产物的全合成，且植物细胞封装的口服递送策略可免去提取纯化步骤，为青蒿素等药物的低成本生产和口服应用提供了可行途径。
创新点
['首次通过叶绿体和核基因组顺序转化，同时表达两个巨生物合成途径，在不影响植物正常生长的情况下实现青蒿素在烟草中的完整生物合成', '将AACPR、DBR2、CYP71AV1靶向叶绿体，利用无糖基化的细胞器环境避免产物修饰，并通过光氧化促进DHAA转化为青蒿素', '将ADS靶向线粒体，利用线粒体中丰富的FPP池提高阿莫地烯产量', '口服整株植物细胞实现青蒿素体内递送，比纯药更有效，免去提取纯化步骤']
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 甲羟戊酸（MEV）途径 | AACT | 乙酰乙酰CoA硫解酶 | 催化 | 叶绿体基因组整合，酵母来源 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 甲羟戊酸（MEV）途径 | HMGS | HMG-CoA合酶 | 催化 | 叶绿体基因组整合，酵母来源 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 甲羟戊酸（MEV）途径 | HMGRt | C-末端截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 叶绿体基因组整合，酵母来源 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 甲羟戊酸（MEV）途径 | MVK | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 叶绿体基因组整合，酵母来源 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 甲羟戊酸（MEV）途径 | PMK | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 叶绿体基因组整合，酵母来源 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 甲羟戊酸（MEV）途径 | PMD | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 | 催化 | 叶绿体基因组整合，酵母来源 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 青蒿素生物合成途径 | IDI | IPP/DMAPP异构酶 | 催化 | 核基因组表达，受APX启动子驱动 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 青蒿素生物合成途径 | FPP | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 核基因组表达，受CsVMV启动子驱动，来自大肠杆菌 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 青蒿素生物合成途径 | ADS | 阿莫地-4,11-二烯合酶 | 催化 | 融合cox4线粒体信号肽靶向线粒体 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 青蒿素生物合成途径 | CYP71AV1 | 阿莫地-4,11-二烯C-12氧化酶（细胞色素P450） | 催化 | 融合叶绿体转运肽靶向叶绿体，受双增强子CaMV 35S启动子驱动 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 青蒿素生物合成途径 | AACPR | 黄花蒿细胞色素P450还原酶 | 催化 | 融合叶绿体转运肽靶向叶绿体，为CYP71AV1提供电子 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 青蒿素生物合成途径 | DBR2 | 双键还原酶2 | 催化 | 融合rbcS1叶绿体转运肽靶向叶绿体，受双增强子CaMV 35S启动子驱动 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 亚细胞定位 | cox4 | COX4线粒体靶向信号肽 | 区室化 | 用于将ADS靶向线粒体 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1） | 亚细胞定位 | rbcS1 | 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基转运肽 | 区室化 | 用于将DBR2靶向叶绿体 |
关键发现
['双转基因烟草（DT1-DT4）青蒿素含量达0.3-0.8 mg/g干重，最高DT4为0.8 mg/g（877±40 μg/g干重），远高于此前报道的6.8 μg/g干重', 'DT4叶片中二氢青蒿酸（DHAA）积累达150 μg/g干重，阿莫地烯达60 μg/g干重', '双转基因植物IPP/DMAPP总量较野生型提高约3倍（DT4为253±20 ng/g鲜重，野生型为80±6 ng/g鲜重）', 'DT4部分纯化提取物对恶性疟原虫（P. falciparum 3D7）的IC50约为79 nM', '口服DT4干燥叶片（剂量24 mg/kg）的小鼠在第10天寄生虫血症从约2.5%降至约1.6%，效果优于纯青蒿素', 'DT植物叶绿素和类胡萝卜素含量略有下降，但整体生长和形态未受严重影响']
研究结论
通过叶绿体-细胞核顺序转化和亚细胞区室化靶向策略，在烟草中实现了青蒿素的完整生物合成（约0.8 mg/g干重），并证明口服生物封装于植物细胞中的青蒿素具有高于纯药的抗疟疗效，为低成本生产和口服递送青蒿素及其他药物提供了可行途径。