Cloning and functional characterization of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyltransferase (GbMECT) gene from Ginkgo biloba
- 作者
- Sang-Min Kim, Tomohisa Kuzuyama, Yung-Jin Chang, Hyung-Jin Kwon, Soo-Un Kim
- 单位
- Program in Applied Life Chemistry, School of Agricultural Biotechnology, Seoul National University; Plant Metabolism Research Center, Kyung Hee University; Laboratory of Cell Biotechnology, Biotechnology Research Center, University of Tokyo; Department of Biological Science, Myongji University
- 杂志
- Phytochemistry（2006）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2006.05.034
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并功能鉴定银杏（Ginkgo biloba）中参与银杏内酯生物合成的2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶（GbMECT）基因，并研究其亚细胞定位和转录特性。
研究策略
基于保守序列进行RACE克隆获得全长cDNA；通过生物信息学分析预测转运肽；利用大肠杆菌ygbP敲除突变株NMW33进行功能互补实验验证酶活性；构建GFP融合蛋白在拟南芥原生质体中瞬时表达分析蛋白定位；采用实时PCR检测胚胎培养组织中基因转录水平。
核心内容
该研究首次从银杏中克隆并功能鉴定了参与银杏内酯生物合成的2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因GbMECT。通过RACE技术获得全长cDNA，其开放阅读框为984 bp，编码327个氨基酸，理论分子量36.3 kDa。利用大肠杆菌ygbP敲除突变株NMW33的功能互补实验证实，去除预测转运肽后的成熟蛋白能恢复突变株在不含甲羟戊酸培养基上的生长，确证GbMECT具有MECT酶活性。亚细胞定位实验表明，全长GbMECT-GFP融合蛋白进入叶绿体并可能与类囊体结合，而删除N端88个氨基酸残基后蛋白滞留于细胞质，说明这88个残基构成的转运肽对叶绿体转运至关重要。转录分析显示该基因在胚胎根和叶中表达相对恒定。系统进化分析表明GbMECT与裸子植物MECT形成独立进化枝，研究为阐明银杏内酯生物合成的MEP途径调控机制提供了分子基础。
创新点
首次从银杏中克隆并功能表征MECT基因；通过互补实验证实GbMECT具有MECT酶活性；发现全长N端88个氨基酸残基是将蛋白转运入叶绿体所必需，且蛋白可能定位于类囊体；系统进化分析显示GbMECT与裸子植物MECT形成独立于被子植物的进化枝。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ginkgo biloba | MEP pathway | GbMECT | GbMECT | 催化 | 从银杏胚胎根克隆的MECT基因，催化MEP生成CDP-ME，参与银杏内酯生物合成 |
| Escherichia coli NMW33 | MEP pathway | ygbP (EcMECT) | EcMECT | 催化 | ygbP基因突变株，携带有甲羟戊酸途径基因的pTMV20KM质粒，用于GbMECT功能互补验证 |
| Arabidopsis thaliana原生质体 | MEP pathway | GbMECT | GbMECT-GFP融合蛋白 | 区室化 | 瞬时表达分析GbMECT及其截短体的亚细胞定位，证实88个N端残基为叶绿体转运所需 |
关键发现
- GbMECT cDNA全长1411 bp，含984 bp开放阅读框，编码327个氨基酸，理论分子量36.3 kDa，理论pI 9.08。DNA水平与拟南芥AtMECT和水稻OsMECT的一致性分别为70.7%和70.2%
- 去除预测转运肽（A88处切割）后成熟蛋白与拟南芥和水稻的氨基酸一致性分别为75.8%和74.5%。GbMECT(Δ35)-pMW能恢复大肠杆菌NMW33（ygbP敲除）在不含甲羟戊酸培养基上的生长，证实其功能。转录水平分析显示GbMECT在胚胎根和叶中保持相对恒定。蛋白定位实验表明，全长GbMECT-smGFP进入叶绿体并可能与类囊体结合，Δ35截短体与叶绿体被膜相关，Δ88截短体留在细胞质，因此完整的88个N端残基对于叶绿体转运是必需的。
研究结论
GbMECT是银杏MEP途径中具有功能的MECT酶，参与银杏内酯生物合成；其N端含有长度为88个氨基酸的叶绿体转运肽，并可能定位于类囊体。