Functional genomics and the biosynthesis of artemisinin
- 作者
- Patrick S. Covello, Keat H. Teoh, Devin R. Polichuk, Darwin W. Reed, Goska Nowak
- 单位
- Plant Biotechnology Institute, 110 Gymnasium Place, Saskatoon, SK, Canada S7N OW9
- 杂志
- Phytochemistry（2007）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2007.02.016
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
黄花蒿中青蒿素含量仅为0.01%-1.5%，难以满足全球抗疟疾药物需求，需要阐明其生物合成途径并鉴定关键酶基因，以通过代谢工程提高产量。
研究策略
采用功能基因组学策略：分离黄花蒿腺毛细胞，构建花蕾、腺毛和消减cDNA文库，通过EST分析筛选候选细胞色素P450基因，并在酿酒酵母WAT11菌株中异源表达，以鉴定其催化功能。
核心内容
青蒿素是治疗疟疾的关键药物，但黄花蒿中其含量极低（仅0.01%–1.5%），难以满足全球需求。该研究采用功能基因组学策略解析青蒿素生物合成途径：通过分离黄花蒿腺毛细胞，构建花蕾、腺毛及消减cDNA文库，分别获得1559、3674和3524条EST序列，从中筛选候选细胞色素P450基因，并在酿酒酵母WAT11菌株中异源表达以鉴定功能。研究发现，CYP71AV1所在P450序列在腺毛文库中占比达1.2%，显著高于其他文库，提示其与腺毛中青蒿素合成密切相关。酵母表达实验证实，CYP71AV1是一种多功能细胞色素P450，在NADPH存在下可将紫穗槐-4,11-二烯依次氧化为青蒿醇、青蒿醛并最终生成青蒿酸。该工作首次克隆并功能鉴定了这一关键酶，证实青蒿素生物合成定位于腺毛，为后续在微生物中重建青蒿酸合成途径、通过代谢工程提高青蒿素产量奠定了重要基础，但双键还原酶等后续步骤仍有待阐明。
创新点
1. 建立了一套基于分离腺毛的EST功能基因组学方法，有效地富集并鉴定了青蒿素生物合成相关基因；2. 首次克隆并功能鉴定了CYP71AV1，证明其是多功能细胞色素P450，可催化紫穗槐-4,11-二烯经青蒿醇、青蒿醛连续氧化生成青蒿酸。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua（黄花蒿） | 青蒿素生物合成 | CYP71AV1 | CYP71AV1（细胞色素P450） | 催化 | 在腺毛中特异高表达，催化紫穗槐-4,11-二烯经青蒿醇、青蒿醛生成青蒿酸的三步连续氧化。 |
| Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母） | 青蒿素生物合成（异源表达） | CYP71AV1 | CYP71AV1（细胞色素P450） | 催化 | 在酵母WAT11菌株中异源表达，其微粒体膜在NADPH存在下能氧化紫穗槐-4,11-二烯生成青蒿醇，并进一步氧化生成青蒿酸。 |
| Artemisia annua（黄花蒿） | 青蒿素生物合成 | ADS | 紫穗槐-4,11-二烯合酶 | 催化 | 催化法尼基焦磷酸（FPP）环化生成紫穗槐-4,11-二烯，是青蒿素生物合成的第一个关键酶。 |
| Artemisia annua（黄花蒿） | 甲羟戊酸途径（萜类前体合成） | FPS | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）缩合生成法尼基焦磷酸（FPP），为倍半萜合成提供前体。 |
关键发现
- 黄花蒿中青蒿素含量仅为0.01%-1.5%
- 构建的AAFB、AAGST和GST-SUB三个cDNA文库分别获得1559、3674和3524条EST
- 在EST文库中，CYP71AV1所在的P450序列在花蕾、腺毛和消减文库中的比例分别为0.1%、1.2%和0.3%
- CYP71AV1与烟草CYP71D16氨基酸序列同一性为49%
- 酵母异源表达表明CYP71AV1在NADPH存在下能将紫穗槐-4,11-二烯氧化为青蒿醇，并将青蒿醇和青蒿醛依次氧化为青蒿酸。
研究结论
克隆并表征CYP71AV1是理解青蒿素生物合成的重要进展，证实青蒿素生物合成定位于腺毛。该研究为通过代谢工程（如在微生物中重建青蒿酸合成）提高青蒿素产量奠定了基础，未来仍需解析双键还原酶等后续步骤。