高级醇 · 代谢工程文献库

← 返回列表

Steviol glycoside biosynthesis

作者
J.E. Brandle, P.G. Telmer
单位
Southern Crop Protection and Food Research Center, 1391 Sandford Street, London, Ont., Canada N5V 4T3
杂志
Phytochemistry（2007）
DOI
10.1016/j.phytochem.2007.02.010
所属领域
植物代谢工程
关键词
AsteraceaeBiosynthesisDiterpene glycosideGlucosyltransferaseP450SteviaStevia rebaudianaTerpene cyclase
阅读原文
查看 PDF 原文

解决的核心问题

解析甜菊糖苷生物合成途径的完整基因网络、酶功能、亚细胞定位及液泡转运机制

研究策略

结合EST基因组学与植物生物化学，通过异源表达、基因互补、GFP融合定位和酶活性分析等方法克隆并功能表征途径中的关键酶

研究路线图

100%
研究目标：解析甜菊糖苷生物合成完整网络
策略：EST基因组学+植物生物化学+异源表达
关键改造：基因克隆与功能验证（DXS/DXR/CDPS/KS/KO/UGTs）
关键发现：亚细胞定位与代谢通道假说
主要结果：酶功能解析与甜度评估
结论：合成分区进行，质体/内质网/细胞质协同
展望：液泡转运机制与steviolbioside合酶鉴定
Text is not SVG - cannot display

下载 .drawio 源文件

核心内容

本研究系统解析了甜菊（Stevia rebaudiana）中甜菊糖苷生物合成的完整基因网络与亚细胞定位机制。通过EST基因组学、异源表达、GFP融合定位及酶活性分析，克隆并功能验证了MEP途径（DXS、DXR等）、二萜环化（CDPS、KS）及糖基转移酶（UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1）等关键酶。研究发现KO定位于内质网而非此前认为的叶绿体，三个UGT则定位于细胞质，据此提出代谢通道假说，并纠正了KAH蛋白纯化的错误鉴定。关键结果表明，甜菊糖苷中stevioside甜度为蔗糖的143倍，rebaudioside A为242倍；纯stevioside每日摄入750 mg对人体血压和胰岛素无显著影响，WHO暂定每日可接受摄入量为0–2 mg/kg体重。研究证实甜菊糖苷合成仅发生在绿色组织，从质体中的kaurene合成到内质网表面的氧化及细胞质中的糖基化形成完整区室化途径，为未来聚焦液泡转运机制及steviolbioside合酶的鉴定指明了方向。

创新点

系统阐明了甜菊糖苷生物合成途径，发现KO定位于内质网而非叶绿体，UGT定位于细胞质，并提出代谢通道假说；纠正了KAH蛋白纯化的错误鉴定

研究对象（19）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
E. coli MC4100 (dxs::CAT) MEP途径 DXS DXS (1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase) 催化 催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生成DXP，互补实验验证功能
E. coli MC4100 (dxr::TET) MEP途径 DXR DXR (1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase) 催化 催化DXP还原重排为MEP，互补实验验证功能
Stevia rebaudiana MEP途径 CMS CMS (4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase) 催化 推测功能，序列已提交GenBank
Stevia rebaudiana MEP途径 CMK CMK (4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase) 催化 推测功能，序列已提交GenBank
Stevia rebaudiana MEP途径 MCS MCS (4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase) 催化 推测功能，序列已提交GenBank
Stevia rebaudiana MEP途径 HDS HDS (1-hydroxy-2-methyl-2(E)-butenyl 4-diphosphate synthase) 催化 推测功能，序列已提交GenBank
Stevia rebaudiana MEP途径 HDR HDR (1-hydroxy-2-methyl-2(E)-butenyl 4-diphosphate reductase) 催化 推测功能，序列已提交GenBank
Stevia rebaudiana 二萜前体合成 GGDPS GGDPS (geranylgeranyl diphosphate synthase) 催化 推测功能，催化IPP和DMAPP缩合生成GGDP
Stevia rebaudiana 二萜环化 CDPS CDPS (copalyl diphosphate synthase) 催化 催化GGDP质子化环化生成CDP，在叶片实质细胞中表达
Stevia rebaudiana 二萜环化 KS KS (kaurene synthase) 催化 催化CDP电离环化生成kaurene，在叶片实质细胞中表达
Saccharomyces cerevisiae WAT21 甜菊醇合成 KO KO (kaurene oxidase, CYP701A5) 催化 P450单加氧酶，三步氧化kaurene生成kaurenoic acid，定位于内质网
Saccharomyces cerevisiae WAT21 甜菊醇合成 KAH KAH (kaurenoic acid 13-hydroxylase) 催化 P450酶，催化kaurenoic acid羟基化生成steviol，是途径的第一个特异性步骤；基因序列未正式发表
E. coli 甜菊糖苷糖基化 UGT85C2 UGT85C2 (UDP-glycosyltransferase) 催化 催化steviol C13-羟基糖基化生成steviolmonoside，定位在细胞质
E. coli 甜菊糖苷糖基化 UGT74G1 UGT74G1 (UDP-glycosyltransferase) 催化 催化steviolbioside C19-羧基糖基化生成stevioside，定位在细胞质
E. coli 甜菊糖苷糖基化 UGT76G1 UGT76G1 (UDP-glycosyltransferase) 催化 催化stevioside C13-葡萄糖C3'糖基化生成rebaudioside A，定位在细胞质
Stevia rebaudiana 甜菊糖苷糖基化 未鉴定UGT 推测为steviolbioside合酶 催化 负责将steviolmonoside C13-葡萄糖C2'糖基化生成steviolbioside，尚未克隆
Stevia rebaudiana 液泡转运 MFS转运蛋白候选 Major Facilitator超家族转运蛋白 转运 候选基因，可能参与甜菊糖苷液泡转运，功能验证中
Stevia rebaudiana 液泡转运 MATE转运蛋白候选 Multidrug and Toxic Compound Extrusion家族转运蛋白 转运 候选基因，可能参与甜菊糖苷液泡转运，功能验证中
Stevia rebaudiana 液泡转运 ABC转运蛋白候选 ATP Binding Cassette超家族转运蛋白 转运 候选基因，可能参与甜菊糖苷液泡转运，功能验证中

关键发现

  1. 甜菊糖苷甜度分别为stevioside 143倍、rebaudioside A 242倍于蔗糖
  2. Stevia中GA浓度约1.2 μg/kg鲜重
  3. 纯stevioside 750 mg/day对人体血压和胰岛素无影响
  4. WHO暂定甜菊糖苷每日可接受摄入量0-2 mg/kg体重
  5. 克隆并功能验证了DXS、DXR、CDPS、KS、KO、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1
  6. KO定位于内质网，三个UGT定位于细胞质
  7. 一个未鉴定的UGT负责steviolbioside合成，另有MFS/MATE/ABC转运蛋白候选

研究结论

甜菊糖苷合成仅发生在绿色组织，所有步骤至kaurene在质体中进行，氧化步骤位于内质网表面，糖基化在细胞质中进行；未来的工作应聚焦于液泡转运机制和唯一缺失酶（steviolbioside合酶）的鉴定