Functional characterization of amyrin synthase involved in ursolic acid biosynthesis in Catharanthus roseus leaf epidermis
- 作者
- Fang Yu, Antje M.K. Thamm, Darwin Reed, Nemesio Villa-Ruano, Alfonso Lara Quesada, Edmundo Lozoya Gloria, Patrick Covello, Vincenzo De Luca
- 单位
- Department of Biological Sciences, Brock University; Plant Biotechnology Institute; Universidad de la Sierra Sur; Michael Smith Laboratories, University of British Columbia; Genetic Engineering Department, Cinvestav Campus Guanajuato
- 杂志
- Phytochemistry（2012）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2012.05.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
表征长春花（Catharanthus roseus）叶片表皮中参与熊果酸生物合成的amyrin合酶的功能，并证实叶片表皮是该三萜物质生物合成的场所。
研究策略
利用叶片表皮富集转录组筛选候选amyrin合酶基因，通过酿酒酵母异源表达进行功能鉴定（产物分析），结合激光显微切割和实时RT-PCR分析其组织与发育期表达模式。
核心内容
该研究首次从长春花叶片表皮富集转录组中筛选并克隆了α-amyrin合酶基因CrAS，通过酿酒酵母异源表达对其功能进行了表征。产物分析显示，CrAS催化生成α-amyrin与β-amyrin的比例为5:1，其中α-amyrin积累量为103±19 μg，β-amyrin为21.9±4 μg，总amyrins产量比表达β-amyrin合酶SvBS的对照菌株高14倍。结合激光显微切割与实时RT-PCR分析，CrAS仅在叶片表皮中表达，而叶肉、乳管和脉管组织中不表达；在幼苗萌发第1天的相对表达量是第12天的7倍，表明其受发育调控，在幼叶和幼苗早期最为活跃。长春花叶片干重中熊果酸约占2.5%，每对叶片表面熊果酸积累最高可达1 mg。该研究通过化学、生化和分子证据证实了叶片表皮是长春花熊果酸生物合成的主要场所，CrAS为熊果酸提供直接前体，其表达模式与熊果酸在叶表的积累动态一致。
创新点
首次克隆并功能表征长春花的α-amyrin合酶（CrAS），证明其催化产物α-与β-amyrin比例5:1；利用激光显微切割证实叶片表皮是熊果酸生物合成的首选部位；揭示CrAS在幼叶和幼苗早期的高表达模式。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus (长春花) | 三萜生物合成（甲羟戊酸途径/熊果酸生物合成） | CrAS | α-amyrin合酶 (CrAS) | 催化 | 在叶片表皮特异表达，催化(3S)-oxidosqualene环化生成α-和β-amyrin。 |
| Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母) | 三萜生物合成 | CrAS | α-amyrin合酶 (CrAS) | 催化 | 异源表达，产物α-与β-amyrin比例5:1。 |
| Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母) | 三萜生物合成 | SvBS | β-amyrin合酶 (SvBS) | 催化 | 作为对照，主要生成β-amyrin。 |
关键发现
- CrAS在酵母中异源表达后，α-amyrin与β-amyrin的比例为5:1，其中α-amyrin积累量为103±19 μg，β-amyrin为21.9±4 μg，总amyrins产量比表达SvBS菌株高14倍
- 长春花叶片干重中熊果酸约占2.5%，每叶对（leaf pair）表面熊果酸积累最高达1 mg
- CrAS在幼苗萌发第1天相对表达量是第12天的7倍
- 激光显微切割显示CrAS在叶片表皮中表达，而叶肉、乳管、脉管等组织中不表达。
研究结论
本研究通过化学、生化和分子证据证实长春花叶片表皮是熊果酸生物合成的场所；CrAS是一种以α-amyrin为主要产物的amyrin合酶，为熊果酸提供直接前体；其表达受发育调控，在幼叶和幼苗早期最活跃，与熊果酸在叶表的积累动态一致。