Characterization of two genes for the biosynthesis of abietane-type diterpenes in rosemary (Rosmarinus officinalis) glandular trichomes
- 作者
- Kathleen Bruckner, Dragana Božić, David Manzano, Dimitra Papaefthimiou, Irini Pateraki, Ulschan Scheler, Albert Ferrer, Ric C.H. de Vos, Angelos K. Kanellis, Alain Tissier
- 单位
- Leibniz Institute of Plant Biochemistry, Department of Cell and Metabolic Biology; Group of Biotechnology of Pharmaceutical Plants, Laboratory of Pharmacognosy, Department of Pharmaceutical Sciences, Aristotle University of Thessaloniki; Department of Molecular Genetics, Centre for Research in Agricultural Genomics (CSIC-IRTA-UAB-UB); Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Pharmacy, University of Barcelona; Plant Research International, Wageningen University and Research Centre; Netherlands Metabolomics Centre
- 杂志
- Phytochemistry（2014）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2014.01.021
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析迷迭香（Rosmarinus officinalis）中酚类二萜（鼠尾草酸和鼠尾草酚）生物合成途径的前几步，特别是鉴定催化GGDP转化为首个abietane型二萜中间体的关键酶基因。
研究策略
利用迷迭香腺毛中酚类二萜富集的特点，通过转录组数据库挖掘候选二萜合酶基因，结合定量RT-PCR表达分析、系统发育分析、异源表达（本氏烟草瞬时表达和酵母重组表达）及GC-MS产物鉴定，对候选基因进行功能验证。
研究路线图
核心内容
该研究以迷迭香腺毛为对象，解析了酚类二萜（鼠尾草酸、鼠尾草酚）生物合成途径的前两步关键酶。通过转录组挖掘候选二萜合酶基因，结合定量表达分析、系统发育分析和异源表达功能验证，鉴定出两个关键基因RoCPS1和RoKSL1/2。实验表明，RoCPS1催化GGDP生成normal CDP，RoKSL1/2随后将其环化为militradiene，后者可自发氧化为abietatriene。在本氏烟草中共表达RoCPS1与RoKSL1或RoKSL2可产生militradiene（约100 ng/cm²）和abietatriene（约30 ng/cm²），在酵母中异源表达也能获得相同产物。表达分析显示RoKSL2在幼叶腺毛中的表达量极高（相对叶片达3972倍），而RoKSL1表达量不足其1%，表明RoKSL2是腺毛中负责该步骤的主要酶。系统发育分析将RoCPS1归入产生normal CDP的合酶分支，RoKSL1/2则与丹参SmKSL形成独立分支，二者属于丢失γ结构域的TPS-e类酶并具有利用normal CDP和8-OH-CDP的双重底物反应性。该工作首次明确了迷迭香鼠尾草酸途径的前两步催化机制，为后续下游氧化酶研究及异源生产奠定了基础，也为高含量品种选育提供了分子标记。
创新点
首次报道迷迭香中鼠尾草酸生物合成途径的两个关键基因RoCPS1和RoKSL1/2，证明它们依次催化GGDP→normal CDP→militradiene；发现RoKSL1/2属于丢失γ结构域的TPS-e类酶，并具有利用normal CDP和8-OH-CDP的双重底物反应性。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rosmarinus officinalis | 酚类二萜生物合成 | RoCPS1 | 柯巴基二磷酸合酶（copalyl diphosphate synthase） | 催化 | 催化GGDP形成normal stereochemistry的柯巴基二磷酸（CDP） |
| Rosmarinus officinalis | 酚类二萜生物合成 | RoKSL1 | kaurene synthase-like 二萜合酶 | 催化 | 以normal CDP为底物产生militradiene，与RoCPS1共表达时产生militradiene和abietatriene |
| Rosmarinus officinalis | 酚类二萜生物合成 | RoKSL2 | kaurene synthase-like 二萜合酶 | 催化 | 以normal CDP为底物产生militradiene，在腺毛中高表达，是主要贡献酶 |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | RoCPS1, RoKSL1 | 柯巴基二磷酸合酶及kaurene synthase-like酶 | 催化 | 在工程酵母菌株AM113中异源表达，可产生militradiene和abietatriene |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | RoCPS1, RoKSL1, RoKSL2, SmKSL | 二萜合酶（RoCPS1, RoKSL1, RoKSL2, SmKSL） | 催化 | 瞬时共表达验证酶活性，SmKSL为阳性对照，均产生militradiene |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | NtCPS2 | 8-羟基柯巴基二磷酸合酶 | 催化 | 用于底物特异性试验，提供8-OH-CDP，与RoKSL1/2共产生manoyl oxide |
| Salvia miltiorrhiza | 二萜生物合成 | SmKSL | militradiene合酶 | 催化 | 已知的militradiene合酶，用于验证RoCPS1产物构型 |
关键发现
- 迷迭香幼叶中鼠尾草酸含量为10.5 mg/g鲜重，鼠尾草酚为6.7 mg/g鲜重
- 腺毛中主要积累鼠尾草酸。RoCPS1和RoKSL2在幼叶腺毛中相对叶片的表达比分别为93和3972，RoKSL1表达量不超过RoKSL2的1%。RoCPS1与RoKSL1或RoKSL2在本氏烟草中共表达产生militradiene（约100 ng/cm²）和abietatriene（约30 ng/cm²）。在酵母中异源表达RoCPS1和RoKSL1可产生militradiene和abietatriene。RoCPS1与SmCPS的氨基酸序列一致性为63.7%，RoKSLs与SssS的一致性约60%。系统发育显示RoCPS1属于产生normal CDP的二萜合酶分支，RoKSL1/2形成与丹参SmKSL相近的独立分支。
研究结论
迷迭香中鼠尾草酸生物合成的前两步由RoCPS1和RoKSL1/2催化，以GGDP为底物经normal CDP生成militradiene，随后可能自发氧化为abietatriene。RoKSL2是腺毛中负责该步骤的主要酶，RoKSL1可能参与胁迫响应。这些酶可作为培育高酚类二萜含量迷迭香品种的标记基因，并为下游氧化酶研究及异源生产奠定了基础。