Enzymatic and metabolic engineering for efficient production of syringin, sinapyl alcohol 4-O-glucoside, in Arabidopsis thaliana
- 作者
- Yang Chu, Tackmin Kwon, Jaesung Nam
- 单位
- Department of Molecular Biotechnology, Dong-A University, Busan 604-714, South Korea
- 杂志
- Phytochemistry（2014）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2014.03.003
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过酶工程和代谢工程的协同作用，提高丁香苷（syringin）在拟南芥叶片中的生产效率，克服UGT72E3催化活性低及底物（芥子醇）供应不足的双重障碍。
研究策略
采用结构域交换策略构建嵌合糖基转移酶UGT72E3/2，提高UGT72E3对芥子醇的催化活性；同时过表达F5H和MYB58增强苯丙烷代谢途径向芥子醇方向的代谢通量，并通过基因叠加（gene stacking）实现三基因共表达。
核心内容
该研究针对丁香苷在拟南芥叶片中生产效率低的问题，通过酶工程与代谢工程协同策略加以克服。作者采用结构域交换策略构建嵌合糖基转移酶UGT72E3/2，将UGT72E3的部分C末端结构域（含PSPG基序）替换为UGT72E2对应区域，在不改变底物特异性的前提下提高其催化活性；同时利用无CaMV 35S启动子的超级启动子载体过表达F5H和MYB58以增强苯丙烷代谢途径向芥子醇方向的通量，并通过基因叠加实现三基因共表达。结果显示，UGT72E3/2在体外高浓度芥子醇条件下丁香苷产量比UGT72E3高4倍；其过表达植株叶片丁香苷积累量为1.77±0.31 μmol/g DW，较UGT72E3过表达植株增加45%；三基因叠加后叶片丁香苷含量较野生型提高56倍。该研究证明嵌合酶与代谢通量增强的联合策略可有效促进单木质素糖苷在植物中的积累，为植物源活性天然产物的异源高效生产提供了可行思路。
创新点
首次通过部分C末端结构域（含PSPG基序）交换构建UGT72E3/2嵌合酶，在不改变底物特异性的前提下显著提高催化活性；利用无CaMV 35S启动子的超级启动子载体实现三基因稳定叠加，避免共抑制效应。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Arabidopsis thaliana | 苯丙烷代谢途径 | UGT72E3 | UGT72E3 | 催化 | 催化芥子醇糖基化生成丁香苷，底物特异性高但催化活性低 |
| Arabidopsis thaliana | 苯丙烷代谢途径 | UGT72E2 | UGT72E2 | 催化 | 催化松柏醇糖基化生成松柏苷，催化活性高 |
| Arabidopsis thaliana | 苯丙烷代谢途径 | UGT72E3/2（嵌合基因） | UGT72E3/2 | 催化 | 由UGT72E3与UGT72E2部分C端结构域交换获得，保留UGT72E3底物特异性并提高催化活性 |
| Arabidopsis thaliana | 苯丙烷代谢途径 | UGT72E2/3（嵌合基因） | UGT72E2/3 | 催化 | 由UGT72E3与UGT72E2部分C端结构域交换获得，保留UGT72E2底物特异性 |
| Arabidopsis thaliana | 苯丙烷代谢途径 | F5H | ferulate 5-hydroxylase（阿魏酸5-羟化酶） | 催化 | 催化G型木质素单体向S型木质素单体（芥子醇）转化，增加丁香苷底物供应 |
| Arabidopsis thaliana | 苯丙烷代谢途径 | MYB58 | MYB58转录因子 | 调控 | 木质素生物合成转录激活子，激活大多数苯丙烷途径基因表达（F5H除外） |
关键发现
- UGT72E3/2在体外高浓度芥子醇条件下丁香苷产量比UGT72E3高4倍
- UGT72E3/2过表达植株叶片中丁香苷积累量（1.77±0.31 μmol/g DW）比UGT72E3过表达植株（1.19±0.19 μmol/g DW）增加45%
- UGT72E2/3过表达植株松柏苷积累量（3.50±0.48 μmol/g DW）比UGT72E2过表达植株（4.43±0.59 μmol/g DW）减少21%
- 将UGT72E3/2、F5H和MYB58三基因叠加后，叶片丁香苷含量比野生型高56倍。
研究结论
嵌合酶UGT72E3/2结合代谢工程增强苯丙烷途径通量（过表达F5H和MYB58）可协同促进丁香苷在拟南芥叶片中的高效积累，为植物源活性单木质素糖苷的异源高效生产提供了有效策略。