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Functional expression of a putative geraniol 8-hydroxylase by reconstitution of bacterially expressed plant CYP76F45 and NADPH- cytochrome P450 reductase CPR I from Croton stellatipilosus Ohba

作者
Siriluk Sintupachee, Worrawat Promden, Nattaya Ngamrojanavanich, Worapan Sitthithaworn, Wanchai De-Eknamkul
单位
Program in Biotechnology, Faculty of Science, Chulalongkorn University, Bangkok 10330, Thailand; Research Unit for Natural Product Biotechnology, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University, Bangkok 10330, Thailand; Division of General Science, Faculty of Education, Buriram Rajabhat University, Buriram 31000, Thailand; Department of Chemistry, Faculty of Science, Chulalongkorn University, Bangkok 10330, Thailand; Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Srinakharinwirot University, Nakornkoy 26120, Thailand; Department of Pharmacology and Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University, Bangkok 10330, Thailand
杂志
Phytochemistry（2015）
DOI
10.1016/j.phytochem.2015.08.005
所属领域
代谢工程
关键词
19-E-vallesamineCYP76F45Croton stellatipilosus OhbaI型P450还原酶功能表达单萜吲哚生物碱大戟科香叶醇8-羟化酶
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解决的核心问题

鉴定并功能表征来自巴豆（Croton stellatipilosus）的推定香叶醇8-羟化酶（CYP76F45）及其氧化还原伴侣CPR I，并探讨其在单萜吲哚生物碱生物合成中的潜在功能。

研究策略

利用简并PCR和RACE从C. stellatipilosus叶片克隆CYP76F45和CPR I全长cDNA；分别在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白；通过体外重构实验验证酶活性；利用TLC和GC-MS鉴定产物；进行底物特异性分析和动力学测定；通过实时定量PCR分析基因表达，并与生物碱积累进行相关性分析。

研究路线图

100%
核心问题：CYP76F45是否具香叶醇8-羟化酶活性？
关键改造：IPTG诱导表达优化（30°C/18h-40h）
结论：CYP76F45+CPR I构成功能性G8H，参与单萜吲哚生物碱合成
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核心内容

本研究从巴豆叶片中克隆了推定香叶醇8-羟化酶基因CYP76F45（ORF 1521 bp，编码507个氨基酸）及其氧化还原伴侣CsCPR I（ORF 2300 bp，编码711个氨基酸），并分别在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了功能性表达。通过体外重构实验，仅当CYP76F45与CsCPR I共同孵育并添加NADPH时，香叶醇被特异性转化为8-羟基香叶醇（质谱碎片m/z 67, 81, 109, 121, 152），动力学分析显示Km为0.066 μM，Vmax为4.60 nmol/min。底物特异性实验表明该酶对香叶醇和法尼醇的相对活性比接近1:1（18 h时为50:42:8），提示其可能参与多萜类代谢。基因表达分析显示CYP76F45和CsCPR I在芽、叶和嫩枝中的表达水平与单萜吲哚生物碱19-E-vallesamine的积累模式一致。该研究首次证明细菌系统可表达功能性膜结合植物P450系统，并首次报道CYP76F亚家族成员具有香叶醇8-羟化酶活性，为揭示该植物中单萜吲哚生物碱合成的早期羟基化步骤提供了酶学证据，但体内定位与生理功能仍需进一步验证。

创新点

['首次在大肠杆菌中原核表达并重构出具有活性的植物CYP76F45与CPR I组合，证明细菌系统可表达功能性膜结合P450系统。', '首次报道CYP76F亚家族成员具有香叶醇8-羟化酶活性。', '发现该酶对香叶醇和法尼醇的底物偏好比接近1:1，提示其可能参与多萜类代谢。']

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(DE3) 单萜吲哚生物碱生物合成（香叶醇8-羟化步骤） CYP76F45 细胞色素P450单加氧酶CYP76F45 催化 推定的香叶醇8-羟化酶，催化香叶醇C-8位羟基化生成8-羟基香叶醇；也能利用法尼醇和香叶基香叶醇
Escherichia coli BL21(DE3) 单萜吲哚生物碱生物合成（香叶醇8-羟化步骤） CsCPR I NADPH-细胞色素P450还原酶CPR I 能量供给 为CYP76F45提供电子，属于双子叶植物CPR I类

关键发现

  1. 从C. stellatipilosus叶片克隆到CYP76F45（ORF 1521 bp，编码507 aa，预测分子量56.7 kDa，pI
  2. 63）和CsCPR I（ORF 2300 bp，编码711 aa，预测分子量78.7 kDa，pI
  3. 27）。在大肠杆菌BL21(DE3)中，CYP76F45经1 mM IPTG于30°C诱导18 h达最大表达，CsCPR I于30°C诱导40 h达最大表达。仅当CYP76F45与CsCPR I共同孵育并添加NADPH时，香叶醇（GOH）被转化为8-羟基香叶醇（产物保留时间15.2 min，质谱碎片m/z 67,81,109,121,152）。初次动力学分析显示Km=0.066 μM，Vmax=4.60 nmol/min。底物特异性实验表明，GOH、法尼醇（FOH）和香叶基香叶醇（GGH）的相对活性在18 h时为50:42:8，4 h时为54:46:0；柚皮素不被利用。序列同源性分析显示CYP76F45与蓖麻CYP76F36同源性73%，CsCPR I与蓖麻CPR I同源性83%。基因表达分析显示CYP76F45和CsCPR I在芽、叶和嫩枝中表达，水平与推测为19-E-vallesamine的单萜吲哚生物碱的积累模式一致。

研究结论

CYP76F45与CsCPR I协同作用，催化香叶醇C-8位羟基化，构成功能性香叶醇8-羟化酶（G8H）。该酶可能参与C. stellatipilosus中单萜吲哚生物碱（如19-E-vallesamine）的生物合成，但体内定位和生理功能仍需进一步验证。