Two types of alcohol dehydrogenase from Perilla can form citral and perillaldehyde
- 作者
- Naoko Sato-Masumoto, Michiho Ito
- 单位
- Department of Pharmacognosy, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University, 46-29, Yoshida-Shimoadachi, Sakyo-ku, Kyoto 606-8501, Japan
- 杂志
- Phytochemistry（2014）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2014.04.019
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析紫苏中柠檬醛和紫苏醛的生物合成途径，克隆并表征参与香叶醇氧化为柠檬醛的两种醇脱氢酶（AKR和GeDH），并验证从香叶基二磷酸（GPP）到柠檬醛的完整酶促转化。
研究策略
从紫苏EST文库中筛选候选醇脱氢酶基因，通过同源克隆获得AKR和GeDH cDNA，在大肠杆菌中异源表达并纯化，进行底物特异性分析、动力学参数测定，并与香叶醇合酶（PcTps-C）偶联进行体外顺序酶促反应。
核心内容
本研究从紫苏不同化学型中克隆并表征了两个醇脱氢酶基因，分别编码醛酮还原酶（AKR）和香叶醇脱氢酶（GeDH）。在大肠杆菌中异源表达纯化后，底物特异性分析表明二者均以NADP⁺依赖方式催化香叶醇氧化为柠檬醛（香叶醛与橙花醛的混合物），也可催化柠檬醛还原及紫苏醇与紫苏醛的相互转化，但对薄荷醇、芳樟醇等仲/叔醇无活性。动力学数据显示PcGeDH对香叶醇的催化效率（kcat/Km为2.07×10⁻⁵ s⁻¹ M⁻¹）约为PsAKR的6倍。进一步将GeDH与香叶醇合酶PcTps-C偶联，以香叶基二磷酸为底物进行体外顺序反应，主要产物为柠檬醛并伴有少量香叶醇，产物比例与天然C型紫苏精油组成相近。半定量RT-PCR显示两类基因在C型、PA型、PK型紫苏中均有表达，且C型表达量最高。上述结果重建了从香叶基二磷酸经香叶醇到柠檬醛的完整合成路线，并提示AKR和GeDH宽泛的底物特异性可能促进了紫苏精油化学型的多样化。
创新点
首次从紫苏中克隆并表征了两个不同类型的醇脱氢酶（AKR和GeDH），证明二者均可催化香叶醇和紫苏醇的氧化；通过体外偶联反应重建了从GPP到柠檬醛的生物合成途径，且GeDH偶联产物比例与天然C型精油相似。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 紫苏单萜（柠檬醛/紫苏醛）生物合成途径 | PsAKR (GenBank: JX629453) | Aldo-keto reductase (AKR) | 催化 | 来自P. setoyensis，以NADP+氧化香叶醇生成柠檬醛，以NADPH还原柠檬醛；kcat/Km=3.35×10^-6 s^-1 M^-1 |
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 紫苏单萜（柠檬醛/紫苏醛）生物合成途径 | PcGeDH (GenBank: JX855837) | Geraniol dehydrogenase (GeDH) | 催化 | 来自P. citriodora，以NADP+氧化香叶醇生成柠檬醛，也能氧化紫苏醇生成紫苏醛；kcat/Km=2.07×10^-5 s^-1 M^-1 |
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 紫苏单萜（柠檬醛）生物合成途径 | PcTps-C (GenBank: DQ088667) | Geraniol synthase | 催化 | 来自P. citriodora，催化GPP去磷酸化生成香叶醇，需要Mn2+和Mg2+作为辅因子 |
关键发现
- 从紫苏frutescens、citriodora和setoyensis中克隆到AKR和GeDH，AKR cDNA长1062 bp编码354 aa，GeDH cDNA长1080 bp编码360 aa
- PsAKR与丹参AKR氨基酸同一性为66%，PcGeDH与罗勒GeDH同一性高达87.5%，紫苏属内AKR和GeDH各自同一性均>98%，而AKR与GeDH之间仅11.4%
- PsAKR和PcGeDH以NADP+为辅因子可将香叶醇氧化为柠檬醛（香叶醛和橙花醛），以NADPH为辅因子可将柠檬醛还原为香叶醇和橙花醇
- 二者也能催化紫苏醇与紫苏醛的相互转化，但不能氧化薄荷醇和芳樟醇等仲/叔醇
- PcGeDH对香叶醇的kcat/Km为2.07×10^-5 s^-1 M^-1，是PsAKR（3.35×10^-6 s^-1 M^-1）的约6倍
- PcTps-C与PcGeDH偶联以GPP为底物时主要生成柠檬醛，少量香叶醇，比例接近C型精油
- 半定量RT-PCR显示AKR和GeDH基因在C型、PA型、PK型紫苏中均表达，其中C型表达量最高。
研究结论
建立了从香叶基二磷酸（GPP）经香叶醇到柠檬醛的生物合成途径；AKR和GeDH在不同化学型紫苏中均有表达，且底物特异性较宽，这种低底物特异性可能促进了紫苏精油类型的多样性。