Expression of heterologous lycopene β-cyclase gene in flax can cause silencing of its endogenous counterpart by changes in gene-body methylation and in ABA homeostasis mechanism
- 作者
- Aleksandra Boba, Kamil Kostyn, Marta Preisner, Wioleta Wojtasik, Jan Szopa, Anna Kulma
- 单位
- Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw; Department of Genetics, Plant Breeding and Seed Production, Faculty of Life Sciences and Technology, Wroclaw University of Environmental and Plant Sciences
- 杂志
- Plant Physiology and Biochemistry（2018）
- DOI
- 10.1016/j.plaphy.2018.03.023
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
异源表达拟南芥番茄红素β-环化酶基因导致亚麻内源Lulcb基因共抑制的分子机制，以及该过程如何通过ABA稳态影响亚麻对真菌病原体的抗性。
研究策略
以转拟南芥Atlcb基因的亚麻L9和L18株系为材料，通过甲基化敏感限制性酶切分析内源Lulcb基因的甲基化模式，测定基因组总甲基化水平及甲基化相关基因表达，用氮杂胞苷处理验证甲基化对基因表达的影响；同时分析类胡萝卜素合成和代谢、ABA合成与分解相关基因表达，结合外源ABA处理确认ABA对几丁质酶基因的调控。
核心内容
本研究以表达拟南芥番茄红素β-环化酶基因（Atlcb）的亚麻L9和L18株系为材料，探讨异源基因表达引发内源Lulcb基因共抑制的分子机制。通过甲基化敏感限制性酶切分析发现，Lulcb基因编码区+297位点CCGG序列的胞嘧啶甲基化分别增加12%和22%，同时基因组整体5-甲基胞嘧啶水平下降12%和23%，与cmt3转录升高2.5倍、ros1和dme表达下降约半数相吻合；氮杂胞苷处理可将Lulcb转录恢复至野生型的89%，证实甲基化重排介导了基因沉默。类胡萝卜素途径上游psy表达下降60%以上，但ABA含量反因分解酶转录骤降而升高62%，外源ABA处理可使几丁质酶基因转录上调4倍，L9和L18株系中该基因本底表达分别提高11倍和9倍，说明ABA稳态通过激活PR基因增强了对镰刀菌的抗性。该工作揭示了异源基因共抑制中基因体甲基化的新作用位点，并展示了类胡萝卜素代谢通过ABA节点向防御功能灵活转导的调控网络。
创新点
首次揭示亚麻内源Lulcb基因共抑制与基因体CCGG位点甲基化变化相关；发现ABA稳态通过抑制分解代谢维持升高，并激活几丁质酶基因增强抗病性，体现了萜类途径的灵活调控。
研究对象（21）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 类胡萝卜素生物合成 | Lulcb | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | 内源靶基因，被共抑制 |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 类胡萝卜素生物合成 | Atlcb | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | 来自拟南芥的异源基因，与内源基因同源性74% |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 类胡萝卜素生物合成 | psy | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 类胡萝卜素途径关键酶，表达下降60%-68% |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 类胡萝卜素生物合成 | crtiso | 类胡萝卜素异构酶 | 催化 | 在L9中表达略升19% |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 类胡萝卜素生物合成 | lce | 番茄红素ε-环化酶 | 催化 | 在L9中表达略升33% |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 类胡萝卜素分解代谢 | nced3 | 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶3 | 催化 | ABA合成，L9略升10% |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 类胡萝卜素分解代谢 | nced6 | 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶6 | 催化 | ABA合成，表达下降 |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 类胡萝卜素分解代谢 | ccd1 | 类胡萝卜素裂解双加氧酶1 | 催化 | 合成脱辅基类胡萝卜素 |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 类胡萝卜素分解代谢 | ccd7 | 类胡萝卜素裂解双加氧酶7 | 催化 | L9下降30% |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 类胡萝卜素分解代谢 | ccd8 | 类胡萝卜素裂解双加氧酶8 | 催化 | L9下降90% |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | ABA生物合成 | aba2 | ABA缺陷2（短链醇脱氢酶） | 催化 | L9下降50%，L18升高2.1倍 |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | ABA生物合成 | aao | 脱落醛氧化酶 | 催化 | L9下降30% |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | ABA分解代谢 | cyp707a | ABA 8'-羟化酶 | 催化 | 表达下降超过99% |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 植物防御 | chitinase | 几丁质酶 | 催化 | PR蛋白，L9和L18表达分别升高11倍和9倍 |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | DNA甲基化 | cmt3 | 染色质甲基化酶3 | 调控 | 表达升高2-2.5倍，参与CNG甲基化维持 |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | DNA去甲基化 | ros1 | ROS1去甲基化酶 | 调控 | 表达降低45%-58% |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | DNA去甲基化 | dme | DEMETER去甲基化酶 | 调控 | 表达降低45%-66% |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 染色质重塑 | ddm1 | DDM1染色质重塑因子 | 调控 | L18表达下降30% |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 组蛋白修饰 | gcn5 | GCN5组蛋白乙酰转移酶 | 调控 | L18表达下降 |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 组蛋白修饰 | h3k9me | H3K9组蛋白甲基转移酶 | 调控 | 表达下降 |
| 亚麻（Linum usitatissimum cv. Linola） | 组蛋白修饰 | hac1 | HAC1组蛋白乙酰转移酶 | 调控 | L18表达下降57% |
关键发现
- 内源Lulcb基因表达下调约50%
- L9和L18株系中Lulcb基因+297位点胞嘧啶甲基化分别增加12%和22%
- 总基因组5-甲基胞嘧啶水平分别降低12%和23%
- cmt3基因转录水平分别升高2.5倍和2倍，ros1和dme转录水平分别降低45%/58%和45%/66%
- 氮杂胞苷处理后Lulcb基因转录恢复至野生型的92%和89%
- psy基因表达下降60%和68%
- ABA含量分别增加62%和27%
- ABA羟基化酶基因转录水平下降超过99%
- 几丁质酶基因转录水平分别升高11倍和9倍
- 外源ABA处理24小时后几丁质酶基因转录升高4倍。
研究结论
亚麻Lulcb基因沉默由基因体CCGG序列甲基化重排引起，与cmt3上调及ros1/dme下调有关；Lulcb沉默导致类胡萝卜素合成减少，但通过抑制ABA分解使ABA含量升高，进而激活几丁质酶等PR基因，增强对镰刀菌的抗性。