Efficient production of lycopene in Saccharomyces cerevisiae by expression of synthetic crt genes from a plasmid harboring the ADH2 promoter
- 作者
- Ahmed Bahaieldin, Nour O. Gadalla, Saleh M. Al-Garni, Hussein Almehdar, Samah Noor, Sabah M. Hassan, Ahmed M. Shokry, Jamal S.M. Sabir, Norio Murata
- 单位
- Department of Biological Sciences, Faculty of Science, King Abdulaziz University (KAU); Department of Genetics, Faculty of Agriculture, Ain Shams University; Genetics and Cytology Department, Genetic Engineering and Biotechnology Division, National Research Center; Agricultural Genetic Engineering Research Institute (AGERI), Agriculture Research Center (ARC); National Institute for Basic Biology
- 杂志
- Plasmid（2014）
- DOI
- 10.1016/j.plasmid.2014.03.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中高效生产番茄红素，以解决从植物提取或在大肠杆菌等细菌中生产时存在的稳定性差、工业放大困难等问题。
研究策略
根据酿酒酵母密码子偏好性合成来自Erwinia uredovora的crtE、crtB、crtI基因，将其克隆到含ADH2启动子的pKS1穿梭载体中，分步转化酿酒酵母DSY-5，并系统优化培养条件（温度、pH、葡萄糖浓度）以提高番茄红素产量。
核心内容
本研究针对酿酒酵母中番茄红素生产效率低的问题，基于代谢工程策略，将来源于Erwinia uredovora的crtE、crtB和crtI三个合成基因按酿酒酵母密码子偏好性优化后（GC含量由约55%降至约35%），克隆至含ADH2启动子的pKS1穿梭载体并转化酿酒酵母DSY-5。利用ADH2启动子受葡萄糖抑制去阻遏的特性，在葡萄糖耗尽后自动诱导基因表达，免去额外诱导剂。系统优化培养条件后，在35°C、pH 6.0、0.5%初始葡萄糖条件下发酵45小时，番茄红素产量达到3.3 mg/g干细胞重，显著高于此前报道的1.1 mg/g。实验还发现麦角固醇与番茄红素水平呈反比，表明二者竞争共同前体FPP，而RT-PCR与Western blot证实三个合成基因在转录和翻译水平均高效表达。该策略无需诱导剂，且适合工业规模连续发酵，为在酵母中高效合成萜类化合物提供了可行路径。
创新点
首次在酿酒酵母中使用合成crt基因与ADH2启动子组合，实现番茄红素的高效生产；利用ADH2启动子受葡萄糖抑制去阻遏的特性，在葡萄糖耗尽后诱导基因表达，避免了额外诱导剂；番茄红素产量达到3.3 mg/g DCW，高于以往报道的微生物生产水平。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae DSY-5 | 番茄红素生物合成途径（类异戊二烯途径） | crtE | CrtE（GGPP合酶） | 催化 | 源自Erwinia uredovora，按酿酒酵母密码子优化，催化FPP生成GGPP |
| Saccharomyces cerevisiae DSY-5 | 番茄红素生物合成途径（类异戊二烯途径） | crtB | CrtB（八氢番茄红素合酶） | 催化 | 源自Erwinia uredovora，按酿酒酵母密码子优化，催化GGPP生成八氢番茄红素 |
| Saccharomyces cerevisiae DSY-5 | 番茄红素生物合成途径（类异戊二烯途径） | crtI | CrtI（八氢番茄红素脱氢酶） | 催化 | 源自Erwinia uredovora，按酿酒酵母密码子优化，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Saccharomyces cerevisiae DSY-5 | 基因表达调控 | ADH2 promoter | — | 调控 | 葡萄糖抑制/去阻遏启动子，在葡萄糖耗尽后激活crt基因表达 |
关键发现
- 通过表达密码子优化的合成crtE、crtB、crtI基因（GC含量从~55%降至~35%），在酿酒酵母DSY-5中成功合成番茄红素。在最佳培养条件（35°C、pH
- 0、0.5%葡萄糖、45小时）下，番茄红素产量达到3280 μg/g干重（约3.3 mg/g DCW），显著高于此前报道的1.1 mg/g。标准条件（pH
- 0、30°C、2%葡萄糖）下，Line 2产量为1305 μg/g，麦角固醇水平降至960 μg/g，而对照（pKS1）为2450 μg/g。麦角固醇与番茄红素水平呈反比，表明二者竞争共同前体FPP。葡萄糖消耗实验显示，0.5%初始葡萄糖在25小时耗尽后启动番茄红素合成，而2%葡萄糖需35小时耗尽，与ADH2启动子的去阻遏机制一致。RT-PCR和Western blot证实三个合成crt基因在转录和翻译水平均高效表达。
研究结论
使用酿酒酵母偏好的密码子合成crtE、crtB、crtI基因，并利用ADH2启动子的去阻遏特性，可在酿酒酵母中实现最高3.3 mg/g干重的番茄红素产量。最佳培养条件为35°C、pH 6.0、0.5%葡萄糖。该策略无需诱导剂，适合工业规模的连续发酵生产。