Metabolic flux elucidation for large-scale models using \(^{13}\mathrm{C}\) labeled isotopes
- 作者
- Patrick F. Suthers, Anthony P. Burgard, Madhukar S. Dasika, Farnaz Nowroozi, Stephen Van Dien, Jay D. Keasling, Costas D. Maranas
- 单位
- Department of Chemical Engineering, The Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA; Genomatica, Inc, 5405 Morehouse Drive, Suite 210, San Diego, CA 92121, USA; Department of Chemical Engineering, University of California - Berkeley, Gilman Hall, Berkeley, CA 94720-1462, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2007）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2007.05.005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在传统的小规模代谢通量分析模型中，通常忽略许多可能贡献于同位素标记模式的通量路径，且无法处理辅因子平衡等全局约束，导致通量解析存在偏差和歧义。本研究旨在建立大规模大肠杆菌同位素映射模型，结合13C标记实验实现更准确、更全面的通量解析。
研究策略
基于庞大的大肠杆菌基因组规模代谢模型iJR904，通过去除阻塞反应和简化非碳代谢合成路径，构建包含238个反应（350个通量）、184个代谢物和32个交换通量的同位素映射网络。该模型显式平衡ATP、NADH和NADPH等辅因子。通过迭代非线性优化（CONOPT/GAMS）和随机初始通量生成，枚举多个局部最优解，利用χ2检验和F检验进行统计评估，并采用通量范围计算（FluxRange）和模型简化策略来提高解析可靠性。
核心内容
本研究基于大肠杆菌基因组规模代谢模型iJR904，构建了一个包含238个反应、350个通量和184个代谢物的同位素映射网络，该网络显式平衡ATP、NADH和NADPH等辅因子。在连续培养实验中利用20% U-13C葡萄糖标记，通过GC-MS测量了13种氨基酸的32个片段，获得130个独立质量测量数据。采用迭代非线性优化和随机初始通量枚举策略，结合χ2检验与F检验对多个局部最优解进行统计评估。初始模型的最优加权残差平方和为56.4，超过自由度25下95%置信水平的临界值37.7，表明拟合不佳；移除33个冗余通量后，简化模型的自由度增加至56，χ2值为74.4，P=0.5401，成功通过统计检验。乙酸通量的预测范围（8.4-11.5 mM/h）与实验测量值（10.2-12.8 mM/h）良好吻合。在145个非固定净通量中，131个被部分解析，分辨率范围为0.2%至98%。该研究证明了在大规模代谢网络中进行13C通量分析的可行性，通过系统性模型简化能获得统计有效的通量分布，且从完整模型出发再简化比直接使用小规模模型更为可靠，为复杂代谢网络的精确通量解析提供了新方法。
创新点
['首次将同位素标记通量分析扩展到包含350个通量的大规模大肠杆菌代谢网络，而非传统的小规模骨架模型。', '通过迭代枚举大量局部最优解并结合统计检验，处理大规模非线性优化中的多解性问题。', '引入通量分辨率（degree of resolution）量化同位素数据对通量范围的收紧程度。', '提出基于生物学直觉和统计检验的模型简化方法，并验证了从完整模型出发进行简化的必要性。']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | pMevT | 甲羟戊酸合成酶（外源） | 催化 | 从乙酰-CoA合成甲羟戊酸的外源途径 |
| Escherichia coli | 异戊二烯前体合成 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | pMBIS质粒表达，催化IPP与DMAPP异构化 |
| Escherichia coli | 异戊二烯前体合成 | ispA | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | pMBIS质粒表达，催化IPP与DMAPP缩合生成FPP |
| Escherichia coli | amorphadiene合成 | ADS | amorphadiene合酶 | 催化 | pADS质粒表达，催化FPP转化为amorphadiene |
| Escherichia coli | 糖酵解 (EMP) | gapA, pgk, pgm, eno, pyk | GAPD, PGK, PGM, ENO, PYK | 催化 | EMP途径关键酶，通量解析中相关通量得到部分解析 |
| Escherichia coli | 磷酸戊糖途径 (PPP) | rpe, rpi, tktA, tktB, talA, talB | RPE, RPI, TKT1, TKT2, TAL | 催化 | PPP非氧化分支，同位素数据显著缩紧其通量范围 |
| Escherichia coli | TCA循环 | acnA, icdA, sucAB, sucCD | ACONT, ICDHy, AKGD, SUCOAS | 催化 | TCA循环关键酶，通量范围受同位素约束明显 |
| Escherichia coli | 乙醛酸支路 | aceA, aceB | ICL, MALS | 催化 | 回补途径，模型中通量范围被抑制至0-0.4 mM/h |
| Escherichia coli | 回补途径 | ppc, pckA | PPC, PPCK | 催化 | 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和羧激酶，通量范围收窄 |
| Escherichia coli | 能量代谢 | ndh | NADH脱氢酶 | 能量供给 | 氧化磷酸化中NADH氧化驱动ATP合成，模型中辅因子平衡约束 |
| Escherichia coli | 辅因子代谢 | pntA, pntB | 转氢酶 | 能量供给 | NADH和NADPH间的氢转移，平衡辅因子供给 |
| Escherichia coli | 乙酸代谢/转运 | — | 乙酸转运蛋白 | 转运 | 模型预测乙酸外排通量8.4-11.5 mM/h，与实验值10.2-12.8 mM/h一致 |
关键发现
- 构建的模型包含238个反应、350个通量和184个代谢物
- 在连续培养（稀释率0.19 h^-1，OD600=3.9）中利用20% U-13C葡萄糖，通过GC-MS测量了13种氨基酸的32个片段，共获得162个质量条目和130个独立质量测量
- 最优加权残差平方和为56.4，χ2检验（自由度25，95%置信水平最大允许值37.7）表明原始模型拟合不佳（P=0.9997）
- 移除33个冗余通量后，简化模型自由度增加到56，χ2临界值为74.4，P=0.5401，模型通过统计检验
- 乙酸通量的预测范围（8.4-11.5 mM/h）与实验测量值（10.2-12.8 mM/h）吻合
- 共145个非固定净通量中，131个被部分解析（分辨率范围0.2%-98%），125个通量仅靠化学计量约束即被固定。
研究结论
本研究证明在大规模代谢网络中进行13C通量分析是可行的，能够揭示小模型无法分辨的通量歧义，并可通过系统性模型简化获得统计上有效的通量分布。从完整模型出发再根据数据去除冗余路径，比直接使用小规模模型更可靠。该方法可扩展至其他菌株和实验系统，并可用于评估产物合成途径改造对细胞代谢的影响。