Engineering of the pyruvate dehydrogenase bypass in Saccharomyces cerevisiae for high-level production of isoprenoids
- 作者
- Yoichiro Shiba, Eric M. Paradise, James Kirby, Dae-Kyun Ro, Jay D. Keasling
- 单位
- Berkeley Center for Synthetic Biology, Department of Chemical Engineering, University of California; California Institute of Quantitative Biomedical Research, University of California; Department of Bioengineering, University of California; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory
- 杂志
- Metabolic Engineering（2006）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2006.10.005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中合成异戊二烯类化合物（如青蒿二烯）时，甲羟戊酸途径的起始底物乙酰辅酶A供给不足，限制了异戊二烯的高产
研究策略
工程化丙酮酸脱氢酶支路：过表达乙醛脱氢酶（ALD6）和乙酰辅酶A合成酶（ACS1），并引入不受翻译后乙酰化失活调控的沙门氏菌乙酰辅酶A合成酶变体（L641P），以增强乙酰辅酶A向甲羟戊酸途径的碳通量
核心内容
该研究针对酿酒酵母中乙酰辅酶A供给不足限制异戊二烯类化合物高产的问题，通过工程化丙酮酸脱氢酶支路增强碳通量。研究者首先在EPY213背景菌株中分别过表达乙醛脱氢酶ALD6和乙酰辅酶A合成酶ACS1，发现ALD6多拷贝表达使酶活提高19倍，而ACS1过表达仅使青蒿二烯产量提升8–23%，暗示乙酰辅酶A合成酶活性受到翻译后乙酰化失活调控。为此，引入沙门氏菌乙酰辅酶A合成酶L641P变体与ALD6共表达（PDB107），该变体不受失活调控，使乙酰辅酶A合成酶活性达到野生型的4.0倍，乙酸积累较单独过表达ALD6降低54%，青蒿二烯产量达0.435 mM，单位OD产量提高1.8倍。进一步在优化背景EPY224中整合表达上述基因（PDB108），青蒿二烯产量最高达0.604 mM（约120 mg/L），单位OD产量较对照提高1.9倍。结果表明，绕过乙酰辅酶A合成酶的乙酰化调控并增强乙醛脱氢酶活性，可有效将碳流导向甲羟戊酸途径，该策略对酵母中其他异戊二烯类化合物的生产具有推广价值。
创新点
['首次在酿酒酵母中通过工程化丙酮酸脱氢酶支路提高异戊二烯产量', '引入沙门氏菌乙酰辅酶A合成酶L641P变体，绕过酵母中乙酰辅酶A合成酶潜在的翻译后乙酰化失活调控', '通过双基因共表达和背景菌株优化（EPY224）实现青蒿二烯产量超过0.6 mM（约120 mg/L）']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae EPY213 | 丙酮酸脱氢酶支路 | ALD6 | Ald6p（胞质乙醛脱氢酶） | 催化 | 过表达将乙醛脱氢酶活性提高4.6-19倍，促进乙醛转化为乙酸 |
| Saccharomyces cerevisiae EPY213 | 丙酮酸脱氢酶支路 | ACS1 | Acs1p（乙酰辅酶A合成酶） | 催化 | 过表达使乙酰辅酶A合成酶活性提高1.9-2.2倍，降低乙酸积累，青蒿二烯产量提高8-23% |
| Saccharomyces cerevisiae EPY213 | 丙酮酸脱氢酶支路 | acs (Salmonella enterica) | Acs（乙酰辅酶A合成酶）及其L641P变体 | 催化 | 引入野生型acs活性提高但仍积累乙酸；L641P变体不受乙酰化失活调控，活性更高并显著提高青蒿二烯产量 |
| Saccharomyces cerevisiae EPY213/EPY224 | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | 截短HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达以解除甲羟戊酸途径的限速步骤 |
| Saccharomyces cerevisiae EPY224 | 甲羟戊酸途径 | ERG20 | 法呢基焦磷酸合酶（FPP synthase） | 催化 | 额外整合过表达以增强FPP供给 |
| Saccharomyces cerevisiae EPY213/EPY224 | 甾醇合成 | ERG9 | 角鲨烯合酶（squalene synthase） | 催化 | 启动子替换为甲硫氨酸阻遏型启动子PMET3，下调表达以减少FPP分流 |
| Saccharomyces cerevisiae EPY213/EPY224 | 甾醇合成调控 | upc2-1 | UPC2转录因子（半显性突变体） | 调控 | 增强甲羟戊酸途径相关基因的转录 |
| Saccharomyces cerevisiae EPY213/EPY224 | 倍半萜合成 | ADS | 青蒿二烯合酶（amorphadiene synthase） | 催化 | 催化FPP环化生成青蒿二烯，异源表达于多拷贝质粒 |
关键发现
- ['过表达ALD6（多拷贝质粒pRS426ALD6，菌株PDB101）使乙醛脱氢酶比活性较EPY213提高19倍（29.6 vs 约1.6 mU/mg），乙酸积累增加7倍
- 整合表达（PDB102）提高4.6倍', '过表达ACS1（PDB103多拷贝、PDB104整合）使乙酰辅酶A合成酶比活性分别提高2.2倍（26.3 mU/mg）和1.9倍（22.5 mU/mg），青蒿二烯产量提高8-23%', '同时过表达ALD6和ACS1（PDB105）时，乙醛脱氢酶活性比EPY213高约40倍（62.3 mU/mg），但乙酰辅酶A合成酶活性仅高约1.2倍（14.5 mU/mg），导致乙酸积累', '引入沙门氏菌acs L641P变体与ALD6共表达（PDB107），乙酰辅酶A合成酶活性为EPY213的4.0倍（47.0 mU/mg），为PDB105的3.2倍
- 乙酸浓度降至7.6 mM，分别为PDB101和PDB105的54%和44%', 'PDB107的青蒿二烯产量为0.435 mM，单位OD产量（0.224 mM/OD600）为PDB101（0.127 mM/OD600）的1.8倍
- 甲羟戊酸盐达2.52 mM', '在EPY224背景中表达ALD6和acsL641P（PDB108），青蒿二烯产量最高达0.604 mM（约120 mg/L），单位OD产量（0.370 mM/OD600）较EPY224（0.197 mM/OD600）提高1.9倍，甲羟戊酸盐达2.55 mM', 'PDB107比PDB101乙酸水平低6.6 mM，青蒿二烯多产生0.32 mM
- 按9摩尔乙酸合成1摩尔青蒿二烯计算，0.32 mM青蒿二烯对应2.9 mM乙酸，占乙酸差值的44%
- PDB108中对应占79%']
研究结论
工程化丙酮酸脱氢酶支路——过表达乙醛脱氢酶并引入沙门氏菌乙酰辅酶A合成酶L641P变体——能有效增强碳通量进入甲羟戊酸途径，显著提高青蒿二烯产量，该策略可推广至酵母中其他异戊二烯类化合物的生产