Balancing a heterologous mevalonate pathway for improved isoprenoid production in Escherichia coli
- 作者
- Douglas J. Pitera, Chris J. Paddon, Jack D. Newman, Jay D. Keasling
- 单位
- Department of Chemical Engineering, University of California Berkeley; Amyris Biotechnologies Inc.; Department of Bioengineering, University of California Berkeley; Synthetic Biology Department, Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory
- 杂志
- Metabolic Engineering（2007）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2006.11.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在异源甲羟戊酸途径导入大肠杆菌后，途径通量失衡导致中间代谢物HMG-CoA积累并抑制细胞生长，从而限制了异戊二烯类化合物的产量。
研究策略
结合基因滴定、代谢物谱分析和酶活测定，鉴定异源途径的瓶颈步骤（HMG-CoA还原酶活性不足），并通过额外表达tHMGR来平衡途径通量，从而解除生长抑制并提高甲羟戊酸产量。
核心内容
该研究针对异源甲羟戊酸途径引入大肠杆菌后通量失衡导致中间代谢物HMG-CoA积累并抑制细胞生长的问题，通过基因滴定、LC-MS代谢物谱分析和酶活测定相结合的系统方法，鉴定出HMG-CoA还原酶活性不足是途径瓶颈。研究者通过额外表达截短HMG-CoA还原酶（tHMGR）平衡途径通量，成功解除生长抑制并显著提高甲羟戊酸产量。关键结果显示，仅表达HMGS几乎完全抑制细胞生长，而共表达HMGS与tHMGR可将生长恢复至对照水平；高表达MevT操纵子时HMG-CoA积累严重，而额外增加tHMGR拷贝使HMG-CoA还原酶活性提高2.5倍，甲羟戊酸产量增加近2倍；与初始质粒pMevT相比，平衡后的途径使甲羟戊酸产量提高约3倍。该工作证明了平衡异源途径碳通量是优化微生物异戊二烯生物合成的关键决定因素，为类似代谢工程策略提供了方法学参考。
创新点
['鉴定出HMG-CoA积累是导致生长抑制和途径失衡的关键中间代谢物', '通过共表达HMG-CoA还原酶（tHMGR）消除瓶颈，将甲羟戊酸产量提高约3倍', '利用基因滴定（gene titration）和LC-MS代谢物谱分析进行途径平衡的系统性方法']
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | atoB | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶（AACoAT） | 催化 | 催化乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A，过量表达不影响生长 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | HMGS | HMG-CoA合酶 | 催化 | 单独表达导致HMG-CoA积累及严重生长抑制；C159A失活突变消除毒性 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | tHMGI | 截短HMG-CoA还原酶（tHMGR） | 催化 | 将HMG-CoA转化为甲羟戊酸，过表达可解除HMG-CoA毒性并提高产量 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | erg12 | 甲羟戊酸激酶（MK） | 催化 | pMBIS中包含，参与下游转化 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | erg8 | 磷酸甲羟戊酸激酶（PMK） | 催化 | pMBIS中包含，参与下游转化 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | MVD1 | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（MPD） | 催化 | pMBIS中包含，参与下游转化 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | idi | IPP异构酶（IPPI） | 催化 | pMBIS中包含，参与异构化 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | ispA | FPP合酶（FPPS） | 催化 | pMBIS中包含，催化FPP合成 |
| Escherichia coli | 萜烯合成 | ADS | amorphadiene合酶（ADS） | 催化 | 催化FPP环化生成amorphadiene，pADS质粒表达 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | araE, araFGH | AraE转运蛋白及相关蛋白 | 转运 | DP10菌株中araE组成型表达、araFGH删除，以实现PBAAD的均一调控 |
| Escherichia coli | 脂肪酸合成 | 未指定 | 脂肪酸合成途径早期酶系 | 催化 | 可能被HMG-CoA抑制，导致malonyl-CoA积累 |
关键发现
- 增加外源甲羟戊酸补充使amorphadiene产量提高（最高20 mM）
- 高表达MevT操纵子导致HMG-CoA积累并严重抑制生长
- 单独表达HMGS几乎完全抑制生长
- 共表达HMGS与tHMGR（pHMGSR）恢复生长至对照水平
- pBAD33MevT菌株甲羟戊酸产量为15.21 mM（25 h），而pHMGSR仅为0.12 mM，约125倍
- 额外增加tHMGR拷贝（pBAD33MevT + pBAD18HMGR）使甲羟戊酸产量增加近2倍，并将HMG-CoA还原酶活性提高2.5倍
- 与初始质粒pMevT相比，通过平衡途径使甲羟戊酸产量提高3倍
- 所有菌株能量电荷>0.8
- HMG-CoA积累与malonyl-CoA积累同时发生。
研究结论
异源甲羟戊酸途径在大肠杆菌中的通量失衡主要由HMG-CoA还原酶活性不足导致HMG-CoA积累并抑制细胞生长。通过额外表达tHMGR平衡途径通量，可消除生长抑制并显著提高甲羟戊酸产量。该研究证明了平衡异源代谢途径碳通量是优化微生物异戊二烯生物合成的关键决定因素。