Improvement of a CrtO-type of β-carotene ketolase for canthaxanthin production in Methylomonas sp.
- 作者
- Xiao-Song Tang, Joanne Shyr, Luan Tao, Natalia Sedkova, Qiong Cheng
- 单位
- Biological and Chemical Sciences and Engineering, Central Research and Development, E. I. DuPont de Nemours Inc., Wilmington, DE 19880-0328, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2007）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2007.05.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高CrtO型β-胡萝卜素酮化酶在甲基营养菌Methylomonas sp.中合成角黄素（canthaxanthin）的效率，以利用廉价C1底物生产高附加值酮类胡萝卜素。
研究策略
采用易错PCR突变和体外重组技术对来自Rhodococcus erythropolis的crtO基因进行定向进化，在高滴度大肠杆菌WS210中筛选高产角黄素突变体，随后通过基因重排（将crtO*置于操纵子首位并引入idi基因）增强其在Methylomonas sp.中的表达。
核心内容
该研究针对CrtO型β-胡萝卜素酮化酶在底物通量高的宿主中活力不足的问题，通过蛋白质工程与表达优化相结合的策略，显著提升了甲基营养菌Methylomonas sp.合成角黄素的效率。研究者首先采用易错PCR和新型体外重组技术对来源于红球菌的crtO基因进行定向进化，并在高滴度大肠杆菌WS210中筛选高产突变体，获得三个角黄素比例达到约90%的优良突变体，而起始酶仅能产生20%的角黄素。随后通过将优化后的crtO*基因置于操纵子首位并引入idi基因，在Methylomonas MWM1200中角黄素特异性从18%提升至93%，产量超过1000 ppm。DNA测序发现多个重复突变位点，提示这些区域对酶活性至关重要。该研究首次对CrtO型酮化酶进行蛋白质工程改造，证明结合蛋白质定向进化和操纵子结构优化，可有效利用廉价C1底物生产高价值酮类胡萝卜素，改进的CrtO也可应用于其他高产类胡萝卜素宿主。
创新点
['首次对CrtO型β-胡萝卜素酮化酶进行蛋白质工程改造，克服其在底物通量高的宿主中活力不足的问题', '应用新型体外重组技术（重组依赖指数扩增）高效构建嵌合基因文库，避免亲本模板污染', '将蛋白质工程与基因表达优化（操纵子基因顺序）结合，在甲基营养菌中实现角黄素特异性的显著提升']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH10B, WS162, WS210 | 类胡萝卜素生物合成 | crtO | CrtO | 催化 | 来自Rhodococcus erythropolis（GenBank AY705709），β-胡萝卜素酮化酶，经易错PCR和体外重组获得突变体 |
| Escherichia coli WS210 | 类胡萝卜素生物合成 | crtO* (320SHU001) | CrtO* | 催化 | 最优突变体，含Met142Leu、Ala164Val等突变，在E. coli中角黄素约89%，在Methylomonas中通过表达优化达到93% |
| Escherichia coli WS210 | 类胡萝卜素生物合成 | crtW | CrtW | 催化 | 来自Paracoccus sp. N81106（GenBank D58420），作为对照β-胡萝卜素酮化酶，在Methylomonas中角黄素占78% |
| Escherichia coli / Methylomonas sp. 16a | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | CrtE | 催化 | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶，催化FPP→GGPP，来自Pantoea stewartii或Pantoea agglomerans |
| Escherichia coli / Methylomonas sp. 16a | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | CrtB | 催化 | 八氢番茄红素合酶，催化两分子GGPP生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli / Methylomonas sp. 16a | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | CrtI | 催化 | 八氢番茄红素脱氢酶，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Escherichia coli / Methylomonas sp. 16a | 类胡萝卜素生物合成 | crtY | CrtY | 催化 | 番茄红素β-环化酶，催化番茄红素生成β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli / Methylomonas sp. 16a | 类胡萝卜素生物合成 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP异构化，存在于Pantoea agglomerans DC404的基因簇中，可增强β-胡萝卜素合成 |
| Methylomonas sp. 16a (MWM1200) | 类胡萝卜素生物合成 | crtO* (320SHU001) 重排表达 | CrtO* | 催化 | 在pDCQ354中crtO*位于操纵子首位（crtO*EidiYIB），使角黄素比例达到93%，产量>1000 ppm |
关键发现
- 起始CrtO320在E. coli WS210中角黄素占总类胡萝卜素的20%，最佳突变体320SHU019、320SHU001和320SHU017可达到约90%
- 在Methylomonas MWM1200中，起始CrtO320为18%，最佳突变体320SHU001为49%
- 通过将crtO*置于操纵子首位并联合idi基因（pDCQ354），在Methylomonas中角黄素特异性进一步提高至93%，产量超过1000 ppm。对照实验显示，CrtO303在DH10B、WS162、WS210和Methylomonas中的角黄素比例分别为84%、44%、12%和14%，而CrtW在Methylomonas中为78%。DNA测序发现多个重复突变位点（如Met142Leu、Ala164Val、Ile283Val、Arg519Trp、Gln524Arg等），表明这些区域对crtO活性至关重要。
研究结论
通过蛋白质工程和表达优化，成功将CrtO型β-胡萝卜素酮化酶在Methylomonas sp.中的角黄素生产特异性从<18%提升至93%，产量超过1000 ppm，证明该策略可有效利用C1底物生产高价值酮类胡萝卜素，且改进的CrtO可应用于其他高产类胡萝卜素宿主。