Engineering the Saccharomyces cerevisiae isoprenoid pathway for de novo production of aromatic monoterpenes in wine
- 作者
- Óscar Herrero, Daniel Ramón, Margarita Orejas
- 单位
- Departamento de Biotecnología, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Apartado de Correos 73, 46100 Burjassot, Valencia, Spain
- 杂志
- Metabolic Engineering（2008）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2007.11.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母不能高效产生和分泌单萜，且缺乏单萜合酶，导致非芳香葡萄品种酿造的葡萄酒中单萜类香气物质含量低，难以改善酒香。
研究策略
在葡萄酒酵母T73-4中异源表达植物Clarkia breweri的S-芳樟醇合酶基因(LIS)，利用高拷贝质粒和组成型强启动子TDH3驱动表达，以内源类异戊二烯途径中的geranyl diphosphate (GDP)为底物从头合成芳樟醇并通过分泌到胞外积累。
核心内容
该研究通过代谢工程手段，在工业葡萄酒酵母T73-4中异源表达了来自植物Clarkia breweri的S-芳樟醇合酶基因LIS，利用高拷贝质粒和强组成型启动子TDH3驱动表达，以内源类异戊二烯途径产生的香叶基焦磷酸为底物，实现了芳樟醇的从头合成与胞外分泌。在YPD培养基中，重组酵母约5小时开始分泌芳樟醇，最高浓度约77 μg/L；在Parellada葡萄汁微酿条件下，YR64菌株发酵第2天达到最高约26 μg/L，最终葡萄酒中芳樟醇浓度为18.60±1.33 μg/L，而对照菌株仅为1.55和1.57 μg/L，产量超过人类感官阈值（4-10 ppb）至少2倍。芳樟醇的合成不影响酵母生长速率、乙醇耐受性和糖消耗，所有菌株均在8天内完成发酵，质粒稳定性在微酿结束时仍达82%。同时，其他挥发性组分谱无显著变化。该工作首次在工业葡萄酒酵母中功能性表达植物单萜合酶，证明通过代谢工程改善非芳香葡萄品种葡萄酒香气的可行性和实用性。
创新点
1. 首次在工业葡萄酒酵母中功能性表达植物单萜合酶基因（C. breweri LIS）；2. 在不影响酵母发酵性能（生长速率、乙醇耐受、糖消耗）的前提下实现芳樟醇的从头合成，产量超过人类感官阈值；3. 通过部分代谢组学证明重组酵母的挥发性产物谱除芳樟醇外无显著变化。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (wine strain T73-4) | Isoprenoid pathway / Mevalonate pathway | LIS (Clarkia breweri, GenBank U58314) | S-linalool synthase | 催化 | 异源表达，以geranyl diphosphate (GDP)为底物催化生成S-linalool |
关键发现
- 在YPD培养基中，重组酵母表达C. breweri LIS后约5小时开始分泌芳樟醇，最高浓度约77 μg/L（在约11小时达到）
- 在Parellada葡萄汁微酿条件下，YR64菌株在发酵第2天达到最高芳樟醇约26 μg/L，最终葡萄酒中芳樟醇浓度为18.60±1.33 μg/L，而对照菌株YR65和T73分别为1.55±0.22和1.57±0.48 μg/L，差异显著（P<0.05）。芳樟醇香气阈值为4-10 ppb，产量超过阈值至少2倍。发酵性能方面，所有菌株均8天内完成发酵，LIS表达不影响生长速率和乙醇耐受性
- 质粒稳定性在YPD培养58h后为97%和93%，微酿结束时为82%。其他挥发性组分（醇、酯、单萜等）无显著变化。
研究结论
通过代谢工程在工业葡萄酒酵母中异源表达植物来源的S-芳樟醇合酶基因，成功实现芳樟醇的从头生物合成，产量超过人类嗅觉阈值，且不影响酵母生长、乙醇耐受和发酵性能，为改善非芳香葡萄品种葡萄酒及酒精饮料的香气提供了可行策略。