Deleting the para-nitrophenyl phosphatase (pNPPase), PHO13, in recombinant Saccharomyces cerevisiae improves growth and ethanol production on D-xylose
- 作者
- Jennifer Headman Van Vleet, Thomas W. Jeffries, Lisbeth Olsson
- 单位
- Center for Microbial Biotechnology, Technical University of Denmark; Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison; Forest Products Laboratory, Forest Service, USDA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2008）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2007.12.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
重组酿酒酵母中过表达木酮糖激酶（尤其来自P. stipitis的XYL3）导致在木糖培养基上的生长抑制，限制了木糖向乙醇的转化效率。
研究策略
在CEN.PK标准菌株背景下，构建PHO13基因缺失菌株，同时过表达P. stipitis的XYL1、XYL2、XYL3基因，通过好氧及微氧批式发酵比较生长、底物消耗和产物生成。
核心内容
本研究在酿酒酵母CEN.PK标准菌株背景下构建了缺失PHO13基因、同时过表达P. stipitis来源的XYL1、XYL2、XYL3的重组菌株，系统考察了PHO13缺失对木糖利用和乙醇生产的影响。通过好氧及微氧批式发酵比较不同菌株的生长、底物消耗和产物生成，发现PHO13缺失可完全解除6%高浓度木糖引起的生长抑制。在以木糖为唯一碳源的好氧培养中，缺失菌株最大比生长速率和体积木糖消耗速率分别达0.10 h⁻¹和20.8 Cmmol h⁻¹，均为亲本的10倍以上；微氧条件下比乙醇生产速率提高10倍，体积乙醇生产速率超过亲本20倍，乙醇得率从0.066提升至0.315 Cmmol/Cmmol。此外，缺失菌株乙酸产量升高（比生成速率0.32对0.18 Cmmol gDCW⁻¹ h⁻¹），甘油产量降低约10倍，提示PHO13缺失可能通过改善细胞内氧化还原平衡发挥作用。该策略为高效木糖发酵菌株的理性改造提供了可行途径。
创新点
['首次在CEN.PK遗传背景下系统研究PHO13缺失对木糖利用的影响，排除了L2612背景中其他缺陷的干扰。', '证实PHO13缺失可完全解除高浓度（6%）木糖对重组菌生长的抑制。', '发现PHO13缺失菌株在木糖上乙酸产量升高、甘油产量降低，提示氧化还原平衡的改善。']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK | 木糖代谢途径（木糖→木糖醇→木酮糖→木酮糖-5-磷酸） | PHO13 | Pho13p | 调控 | 对硝基苯磷酸酶，缺失可缓解XYL3过表达导致的木糖生长抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK | 木糖代谢途径 | PsXYL1 | Xyl1p | 催化 | 木糖还原酶，来源于Pichia stipitis，催化木糖还原为木糖醇 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK | 木糖代谢途径 | PsXYL2 | Xyl2p | 催化 | 木糖醇脱氢酶，来源于Pichia stipitis，催化木糖醇氧化为木酮糖 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK | 木糖代谢途径 | PsXYL3 | Xyl3p | 催化 | D-木酮糖激酶，来源于Pichia stipitis，过表达导致生长抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK | 木糖代谢途径 | ScXKS1 | Xks1p | 催化 | 内源D-木酮糖激酶，过表达同样引起生长抑制（文献报道） |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK | 磷酸戊糖途径 | TAL1 | Tal1p | 催化 | 转醛醇酶，上调可缓解木糖生长抑制（相关突变报道） |
关键发现
- ['在葡萄糖培养中，PHO13缺失菌株的乙酸比生成速率（0.32 Cmmol gDCW⁻¹ h⁻¹）是野生型（0.18）的1.8倍，乙酸得率（0.015 Cmmol/Cmmol）是野生型（0.008）的1.9倍。', '在葡萄糖-木糖混合糖培养中，PHO13缺失菌株在木糖-乙醇共利用阶段的比生长速率（0.13 h⁻¹）和比木糖摄取速率（2.68 Cmmol gDCW⁻¹ h⁻¹）分别约为亲本菌株（0.09 h⁻¹和1.69 Cmmol gDCW⁻¹ h⁻¹）的1.5倍，体积木糖消耗速率超过亲本的2倍。', '在以木糖为唯一碳源的好氧培养中，PHO13缺失菌株的最大比生长速率（0.10 h⁻¹）和体积木糖消耗速率（20.8 Cmmol h⁻¹）均为亲本（0.01 h⁻¹和1.86 Cmmol h⁻¹）的10倍以上，比木糖摄取速率（3.45 Cmmol gDCW⁻¹ h⁻¹）为亲本（1.86）的1.5倍以上。', '在微氧木糖培养中，PHO13缺失菌株的最大比生长速率（0.062 h⁻¹）为亲本（0.017 h⁻¹）的3.5倍；比乙醇生产速率（0.64 Cmmol gDCW⁻¹ h⁻¹）为亲本（0.07）的10倍；体积乙醇生产速率（2.05 vs
- 09 Cmmol L⁻¹ h⁻¹）超过亲本的20倍；乙醇得率（0.315 Cmmol/Cmmol）为亲本（0.066）的5倍。', 'PHO13缺失菌株在木糖上甘油产量显著下降：好氧条件下比甘油生产速率（0.035 vs
- 59 Cmmol gDCW⁻¹ h⁻¹）和甘油得率（0.01 vs
- 31 Cmmol/Cmmol）均降低约10倍。']
研究结论
在过表达木酮糖激酶的重组酿酒酵母中，删除PHO13基因能够有效解除木糖生长抑制，显著提高木糖消耗速率、生长速率和乙醇产量，并伴随乙酸增加和甘油减少，表明其可能通过改变细胞内氧化还原平衡来实现改善。该策略为开发高效木糖发酵菌株提供了可行途径。