Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol and 1-propanol production via the keto-acid pathways
- 作者
- C.R. Shen, J.C. Liao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California
- 杂志
- Metabolic Engineering（2008）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2008.08.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在大肠杆菌中通过酮酸途径实现1-丁醇和1-丙醇的微生物生产，克服梭菌难以基因操作的问题，并利用天然氨基酸途径避免辅酶A毒性中间体积累。
研究策略
利用微生物氨基酸生物合成途径的2-酮酸中间体，异源表达酮酸脱羧酶(Kivd)和醇脱氢酶(ADH2)，过表达苏氨酸途径及正缬氨酸途径关键酶，并通过解除反馈抑制和敲除竞争途径提高前体供给。
核心内容
本研究在大肠杆菌中通过酮酸途径实现了1-丁醇和1-丙醇的微生物共生产，以规避梭菌基因操作困难及辅酶A毒性中间体积累的问题。研究策略上，异源表达了乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶Kivd和酿酒酵母的醇脱氢酶ADH2，并系统过表达了苏氨酸途径及正缬氨酸延伸途径的关键酶，同时解除反馈抑制并敲除竞争途径以增强前体供给。最终菌株CRS-BuOH23共产1-丁醇和1-丙醇约2 g/L，两者比例接近1:1。关键优化中，过表达ilvA和leuABCD使产量提高近5倍，添加8 g/L苏氨酸使产量提升20倍至2 g/L，过表达反馈抗性ThrAbrBC提高3-4倍，敲除metA和tdh使总醇产量达1.2 g/L，敲除ilvB和ilvI使1-丁醇提高2倍，而敲除adhE将乙醇副产物从0.25 g/L降至0.1 g/L。该工作证明了利用氨基酸生物合成途径在大肠杆菌中共生产支链醇的可行性，为后续菌株耐受性改良和发酵优化奠定了基础。
创新点
首次在大肠杆菌中实现1-丁醇和1-丙醇接近1:1的共生产；利用非天然正缬氨酸生物合成途径生成2-酮戊酸作为1-丁醇前体；系统组合氨基酸代谢工程策略。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 (及其衍生物 JCL16) | 全局代谢 | — | — | 调控 | 底盘细胞，通过基因敲除和质粒表达进行工程化 |
| Escherichia coli | 苏氨酸生物合成途径 | thrA, thrB, thrC | 天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶(ThrA), 高丝氨酸激酶(ThrB), 苏氨酸合酶(ThrC) | 催化 | 过表达反馈抗性突变体ThrAbrBC(pCS49)以解除反馈抑制，提高苏氨酸合成 |
| Escherichia coli | 异亮氨酸/苏氨酸降解途径 | ilvA | 苏氨酸脱氨酶(IlvA) | 催化 | 催化苏氨酸脱氨生成2-酮丁酸，过表达于pSA62和pCS51 |
| Escherichia coli | 正缬氨酸合成途径（酮酸链延伸） | leuA, leuB, leuC, leuD | 2-异丙基苹果酸合酶(LeuA), 3-异丙基苹果酸脱氢酶(LeuB), 异丙基苹果酸异构酶亚基(LeuC, LeuD) | 催化 | LeuABCD利用2-酮丁酸经链延伸合成2-酮戊酸（1-丁醇前体），过表达于pSA62；leuAbr(G462D)突变体用于解除反馈抑制（pCS50/pCS51） |
| Lactococcus lactis | 2-酮酸脱羧 | kivd | 2-酮酸脱羧酶(Kivd) | 催化 | 异源表达，催化2-酮丁酸和2-酮戊酸脱羧生成丙醛和丁醛，pSA551 |
| Saccharomyces cerevisiae | 醇脱氢 | ADH2 | 醇脱氢酶2(ADH2) | 催化 | 异源表达，将醛还原为相应醇，pSA551 |
| Escherichia coli | 竞争途径-甲硫氨酸生物合成 | metA | 高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(MetA) | 调控 | 敲除metA以减少高丝氨酸流向甲硫氨酸，保存苏氨酸前体 |
| Escherichia coli | 竞争途径-苏氨酸分解 | tdh | 苏氨酸脱氢酶(Tdh) | 调控 | 敲除tdh阻断苏氨酸分解为2-氨基-3-酮丁酸 |
| Escherichia coli | 支链氨基酸生物合成 | ilvB, ilvI | 乙酰羟酸合酶I和III的催化亚基(IlvB, IlvI) | 调控 | 敲除ilvB和ilvI阻断缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸合成，节省2-酮丁酸和乙酰辅酶A |
| Escherichia coli | 乙醇发酵 | adhE | 乙醇脱氢酶/乙醛脱氢酶(AdhE) | 调控 | 敲除adhE降低乙醇副产物，提高目标醇特异性 |
| Escherichia coli | 苏氨酸脱氨（替代途径） | tdcB | 降解型苏氨酸脱氨酶(TdcB) | 催化 | 评估作为IlvA替代，对异亮氨酸反馈抑制不敏感，但产量降低30% |
关键发现
- 最终菌株CRS-BuOH23共产1-丁醇和1-丙醇约2 g/L，比例接近1:1
- 过表达ilvA和leuABCD使产量提高近5倍至60和30 mg/L
- 添加8 g/L苏氨酸使产量提高20倍至2 g/L
- 过表达反馈抗性ThrAbrBC使产量提高3-4倍
- 敲除metA和tdh使总醇产量达1.2 g/L
- 敲除ilvB和ilvI使1-丁醇提高2倍
- 敲除adhE使乙醇从0.25 g/L降至0.1 g/L
- TdcB替代IlvA使目标醇产量降低30%
- leuAbr(G462D)无显著改善。
研究结论
通过氨基酸生物合成途径的代谢工程，成功在大肠杆菌中实现了1-丁醇和1-丙醇的共生产，表明该策略可行，进一步优化菌株耐受性和发酵条件可提高产量。