Metabolic engineering of taxadiene biosynthesis in yeast as a first step towards Taxol (Paclitaxel) production
- 作者
- Benedikt Engels, Pia Dahm, Stefan Jennewein
- 单位
- Fraunhofer Institut für Molekularbiologie und Angewandte Ökologie, Forckenbeckstraße 6, 52074 Aachen, Germany; Institut für Organische Chemie und Biochemie, Technische Universität Darmstadt, Petersenerstraße 22, 64287 Darmstadt, Germany
- 杂志
- Metabolic Engineering（2008）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2008.03.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇（Taxol）天然来源产量低、提取困难，化学合成复杂昂贵，需要在微生物中建立紫杉醇前体taxadiene的高效合成途径。
研究策略
在酿酒酵母中异源表达紫杉烷生物合成早期酶（taxadiene synthase和geranylgeranyl diphosphate synthase），同时通过表达截短的HMG-CoA还原酶解除甾醇反馈抑制、表达UPC2-1突变体促进甾醇摄取以降低竞争、更换GGPP合酶来源以避免与甾醇合成争夺FPP，并对taxadiene synthase进行密码子优化，逐步提高taxadiene产量。
核心内容
该研究以酿酒酵母为宿主，系统构建紫杉醇关键前体taxadiene的异源合成途径。研究者首先在野生型CEN.PK2-1C菌株中共表达红豆杉来源的GGPP合酶和taxadiene合酶，获得204 μg/L的taxadiene产量；随后引入截短的HMG-CoA还原酶以解除甾醇反馈抑制，使产量提高50%至306 μg/L。将GGPP合酶替换为Sulfolobus acidocaldarius来源的酶后，由于该酶优先利用DMAPP而非FPP，避免了与甾醇合成竞争底物，taxadiene产量升至320 μg/L，同时副产物geranylgeraniol积累至27.6 mg/L。最终对taxadiene合酶进行密码子优化，使产量大幅提升约40倍，达到8.7 mg/L。该研究通过组合底物竞争规避、代谢通量强化和密码子优化等策略，首次在酵母中实现了taxadiene的毫克级合成，证明微生物细胞工厂生产紫杉醇前体具有可行性，为后续完整紫杉醇生物合成途径的构建奠定了重要基础。
创新点
首次在酵母中实现taxadiene的高效合成（8.7 mg/L）；使用Sulfolobus acidocaldarius来源的GGPP合酶以DMAPP为底物，避免与甾醇合成竞争FPP；组合多种代谢工程策略协同提升产量。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | taxoid生物合成途径 | Tc-tds | taxadiene synthase | 催化 | 来自Taxus chinensis，去除N端74个氨基酸质体靶向序列的假成熟形式 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | taxoid生物合成途径 | Syn::tds | taxadiene synthase | 催化 | 根据S. cerevisiae密码子偏好优化的合成基因 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | taxoid生物合成途径 | Tc-ggpps | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 来自Taxus chinensis，利用FPP和IPP合成GGPP |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | taxoid生物合成途径 | Sa-ggpps | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 来自Sulfolobus acidocaldarius，通过DMAPP连续加成合成GGPP，不竞争FPP |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 甲羟戊酸途径 | Sc-thmgr1 | truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase | 催化 | 截短的HMG-CoA还原酶同工酶1，不受甾醇反馈抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 甾醇代谢调控 | Sc-upc2.1 | UPC2-1 transcription factor | 调控 | 突变型转录因子，允许有氧条件下外源甾醇摄取，减少内源甾醇合成竞争 |
关键发现
- 野生型酿酒酵母CEN.PK2-1C中GGPP水平仅122±3 μg/L
- 单独表达T. chinensis taxadiene synthase无法产生taxadiene
- 共表达Tc-GGPPS和Tc-TDS产生204±1 μg/L taxadiene
- 加入截短HMG-CoA还原酶(tHMG1)后taxadiene提高50%至306±3 μg/L
- 加入UPC2-1无显著变化
- 将Tc-GGPPS替换为S. acidocaldarius GGPPS后taxadiene为320±3 μg/L，但geranylgeraniol大幅升至27.6±3.4 mg/L（比Tc-GGPPS菌株高近100倍）
- 密码子优化taxadiene synthase后（CEN10）taxadiene达到8.7±0.85 mg/L（约40倍提高），geranylgeraniol为33.1±5.6 mg/L，生物量21.6±2.5 g/L。
研究结论
通过系统性的代谢工程改造，成功在酿酒酵母中建立了taxadiene（紫杉醇生物合成第一个关键中间体）的高效合成体系，产量达8.7 mg/L，为紫杉醇的微生物生产奠定了基础。