Optimization of the mevalonate-based isoprenoid biosynthetic pathway in Escherichia coli for production of the anti-malarial drug precursor amorpha-4,11-diene
- 作者
- Jennifer R. Anthony, Larry C. Anthony, Farnaz Nowroozi, Gina Kwon, Jack D. Newman, Jay D. Keasling
- 单位
- California Institute for Quantitative Biomedical Research, University of California, Berkeley; Amyris Biotechnologies Inc.; Department of Bioengineering, University of California, Berkeley; Department of Chemical Engineering, University of California, Berkeley; Synthetic Biology Department, Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory
- 杂志
- Metabolic Engineering（2008）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2008.07.007
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中基于甲羟戊酸的异戊二烯生物合成途径表达不平衡，导致抗疟药前体amorpha-4,11-diene产量低且代谢负担重
研究策略
开发模块化克隆载体系统，通过启动子替换、密码子优化、基因剂量实验和单质粒整合策略平衡基因表达，鉴定并解除限速步骤
核心内容
该研究针对大肠杆菌中甲羟戊酸途径表达不平衡导致抗疟药前体amorpha-4,11-diene产量低的问题，开发了模块化克隆载体系统。通过启动子替换、密码子优化、基因剂量实验和单质粒整合策略，系统平衡了途径基因表达并鉴定限速步骤。研究首先将原始菌株DH1 pMevT pMBIS pADS的产量从约42 mg/L/OD600提升至221 mg/L/OD600，通过使用lacUV5启动子和密码子优化的MevT实现5倍提高；基因剂量实验进一步表明甲羟戊酸激酶（MK）为限速酶，额外表达使产量提高3倍。最终构建的菌株DH1 pAM45 pAM94在75小时内产量达293 mg/L/OD600，为原始菌株的7倍。研究还发现单质粒整合全部途径会导致产量下降和质粒丢失，补充ADS可部分恢复。结果表明，模块化载体系统能快速优化异源途径，平衡限速酶表达，该策略对代谢工程中其他途径的优化具有广泛适用性。
创新点
构建了具有独特兼容酶切位点的快速克隆系统；鉴定了甲羟戊酸激酶(MK)和amorpha-4,11-diene合酶(ADS)为限速酶；通过优化启动子强度和质粒拷贝数使产量提高7倍
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway) | atoB | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶 (AtoB) | 催化 | MevT操纵子第一个酶，催化乙酰辅酶A缩合 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 | HMGS | HMG-CoA合酶 (HMGS) | 催化 | MevT操纵子；来自酿酒酵母 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | 截短的HMG-CoA还原酶 (tHMGR) | 催化 | MevT操纵子；N端截短 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 | MK | 甲羟戊酸激酶 (MK) | 催化 | MBIS操纵子第一个酶；限速酶，额外拷贝使产量提高3倍 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 | PMK | 磷酸甲羟戊酸激酶 (PMK) | 催化 | MBIS操纵子 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 | PMD | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 (PMD) | 催化 | MBIS操纵子 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 (IdI) | 催化 | MBIS操纵子；催化IPP与DMAPP异构化 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 | ispA | 法尼基焦磷酸合酶 (IspA) | 催化 | MBIS操纵子；催化FPP合成 |
| Escherichia coli DH1 | amorpha-4,11-diene合成途径 | ADS | amorpha-4,11-diene合酶 (ADS) | 催化 | 来自黄花蒿；限速酶，基因剂量影响产量 |
关键发现
- 原始菌株DH1 pMevT pMBIS pADS产量约42 mg/L/OD600
- 使用lacUV5启动子和密码子优化的MevT使产量提高5倍（221 mg/L/OD600）
- 基因剂量实验表明额外表达MK使产量提高3倍
- 最终菌株DH1 pAM45 pAM94达到293 mg/L/OD600（75 h），为原始菌株的7倍
- pAM92在单一质粒中整合全部途径时产量降低，补充ADS后部分恢复但仍有质粒丢失（30%/96h）
研究结论
通过模块化载体系统快速优化甲羟戊酸途径，平衡限速酶表达，最终摇瓶产量达到约300 mg/L/OD600，较原始菌株提升7倍，该策略可推广至其他异源途径的优化