高级醇 · 代谢工程文献库

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Dynamic control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae engineered for the production of plant sesquiterpene α-santalene in a fed-batch mode

作者
Gionata Scalcinati, Christoph Knuf, Siavash Partow, Yun Chen, Jérôme Maury, Michel Schalk, Laurent Daviet, Jens Nielsen, Verena Siewers
单位
Department of Chemical and Biological Engineering, Chalmers University of Technology, SE-412 96 Göteborg, Sweden; Center for Microbial Biotechnology, Department of Systems Biology, Technical University of Denmark, DK-2800 Kgs. Lyngby, Denmark; Firmenich SA, Corporate R&D Division, CH-1211 Geneva 8, Switzerland
杂志
Metabolic Engineering（2012）
DOI
10.1016/j.ymben.2012.01.007
所属领域
代谢工程
关键词
ErgosterolFarnesyl diphosphateIsoprenoidsMetabolic engineeringSaccharomyces cerevisiaeSqualene synthase
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解决的核心问题

如何在酿酒酵母中高效生产植物倍半萜α-檀香烯，特别是通过动态调控ERG9基因表达来分流FPP流向目标产物，同时避免完全敲除ERG9导致的致死性和对外源麦角固醇的依赖。

研究策略

利用葡萄糖浓度响应的启动子（HXT1和HXT2）动态控制鲨烯合酶（Erg9）的表达，在葡萄糖限制的补料分批发酵中下调ERG9；同时过表达截短型HMG-CoA还原酶（tHMG1）增加MVA途径通量，并敲除LPP1和DPP1减少FPP向法尼醇的损耗，结合原位产物移除和补料分批发酵实现α-檀香烯高产。

研究路线图

100%
关键问题：如何在酿酒酵母中高效生产α-檀香烯，并解决ERG9敲除致死问题
策略：葡萄糖响应启动子动态调控ERG9，结合MVA通量增强与副产物削减
改造1：HXT1启动子替换ERG9天然启动子（动态下调ERG9）
改造2：过表达截短tHMG1（增加MVA通量）
改造3：敲除LPP1和DPP1（减少法尼醇损耗）
结果1：HXT1调控使产率提高3.4倍，达0.183 mg/gDCW/h
结果2：tHMG1+敲除LPP1/DPP1增效，产率达0.21 mg/gDCW/h
结果汇总：α-檀香烯达92 mg/L，总倍半萜131 mg/L，麦角固醇降50-91%
结论：动态调控ERG9策略成功实现碳流重定向，达到工业相关产量，可推广至其他酵母源产品
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核心内容

本研究在酿酒酵母中实现了植物倍半萜α-檀香烯的异源生产，并开发了基于葡萄糖浓度响应的动态调控策略以分流法尼基焦磷酸（FPP）流向目标产物。研究者利用HXT1启动子替换鲨烯合酶编码基因ERG9的天然启动子，在补料分批发酵的葡萄糖限制条件下动态下调ERG9表达，从而减少碳流向甾醇合成，同时过表达截短型HMG-CoA还原酶增强甲羟戊酸途径通量，并敲除LPP1和DPP1以减少FPP向法尼醇的副产物损耗。结果显示，HXT1启动子驱动的ERG9动态下调使α-檀香烯生产率提高3.4倍，达到0.183 mg/gDCW h；进一步结合tHMG1过表达和LPP1、DPP1双重敲除后，生产率增至0.21 mg/gDCW h，最终α-檀香烯滴度达92 mg/l，总倍半萜产量为131 mg/l。同时，麦角固醇含量下降50–91%，DPP1缺失使法尼醇积累减少24%。该研究通过动态基因调控避免了完全敲除ERG9的致死性，成功将代谢流从甾醇合成转向目标产物，达到了工业相关产量水平，为酵母中其他异源萜类化合物的生产提供了可推广的调控策略。

创新点

首次在酿酒酵母中实现α-檀香烯的异源生产；采用HXT1启动子替换ERG9天然启动子，实现葡萄糖浓度依赖的动态下调，避免使用昂贵且易被代谢的甲硫氨酸；结合敲除LPP1和DPP1显著减少副产物法尼醇；利用双相原位产物移除补料分批发酵工艺提高产物回收和最终产量。

研究对象（8）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D 甲羟戊酸（MVA）途径 ERG9 鲨烯合酶（Squalene synthase） 催化 通过替换启动子为HXT1或表达反义RNA动态下调，以分流FPP至α-檀香烯合成
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D 甲羟戊酸（MVA）途径 HMG1（tHMG1） 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（截短型） 催化 过表达去除跨膜调控域的截短形式，解除反馈抑制，增加MVA途径通量
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D 甲羟戊酸（MVA）途径 LPP1 脂质磷酸磷酸酶（Lipid phosphate phosphatase） 催化 敲除以减少FPP去磷酸化为法尼醇，提高前体利用
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D 甲羟戊酸（MVA）途径 DPP1 二酰甘油焦磷酸磷酸酶（Diacylglycerol pyrophosphate phosphatase） 催化 敲除进一步减少法尼醇积累，使α-檀香烯生产率从0.18提高至0.21 mg/gDCW h
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D 倍半萜合成 SanSyn 檀香烯合酶（Santalene synthase） 催化 源自Clausena lansium，催化FPP生成α-檀香烯，同时产生少量trans-α-bergamotene（约12%）
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D 葡萄糖感知/调控 HXT1 — 调控 利用其葡萄糖浓度响应启动子替换ERG9启动子，在低糖条件下抑制ERG9表达
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D 葡萄糖感知/调控 HXT2 — 调控 利用其启动子表达ERG9反义RNA，在低糖条件下诱导反义抑制
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D 甲硫氨酸代谢/调控 MET3 — 调控 甲硫氨酸抑制型启动子，作为对照，需外加L-甲硫氨酸维持抑制

关键发现

  1. 使用HXT1启动子控制ERG9表达使α-檀香烯生产率提高3.4倍（从约0.054 mg/gDCW h增至0.183 mg/gDCW h）
  2. 结合tHMG1过表达和LPP1敲除，生产率达0.18 mg/gDCW h
  3. 额外敲除DPP1使生产率进一步增至0.21 mg/gDCW h，最终α-檀香烯滴度达92 mg/l，总倍半萜（α-檀香烯+trans-α-bergamotene）为131 mg/l
  4. 麦角固醇含量降低50-91%
  5. DPP1缺失使法尼醇积累下降24%。

研究结论

通过动态调控ERG9表达成功将碳流从甾醇合成转向α-檀香烯，结合代谢工程（tHMG1过表达、LPP1/DPP1缺失）和补料分批发酵过程优化，实现了工业相关水平的α-檀香烯生产（92 mg/l），该动态调控策略可推广至其他酵母源产品的生产。