Engineering topology and kinetics of sucrose metabolism in Saccharomyces cerevisiae for improved ethanol yield
- 作者
- Thiago O. Basso, Stefan de Kok, Marcelo Dario, Júlio Cézar A. do Espirito-Santo, Gabriela Müller, Paulo S. Schlögl, Carlos P. Silva, Aldo Tondo, Jean-Marc Daran, Andreas K. Gombert, Antonius J.A. van Maris, Jack T. Pronk, Boris U. Stambuk
- 单位
- Department of Biotechnology, Delft University of Technology and Klyuver Centre for Genomics of Industrial Fermentation, Delft, The Netherlands; Department of Chemical Engineering, University of Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil; PPG Interunidades em Biotecnologia, University of Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil; Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Brazil
- 杂志
- Metabolic Engineering（2011）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2011.09.005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决蔗糖代谢拓扑（胞外水解与胞内水解）对乙醇产率的影响问题，并通过工程改造提高乙醇产率。
研究策略
通过改造SUC2基因的启动子和5'编码序列，使蔗糖酶主要定位在胞内，结合实验室进化改善蔗糖转运动力学，并通过转录组分析和基因删除鉴定关键基因。
核心内容
该研究以酿酒酵母CEN.PK113-7D为底盘，通过改变蔗糖代谢的空间拓扑结构来提升乙醇产率。理论预测将蔗糖水解从胞外转移至胞内可使乙醇产率提高约8.7%。研究者通过改造SUC2基因的启动子和5'编码序列，使94%的蔗糖酶定位至胞内，构建出工程菌株iSUC2，其乙醇产率较参考菌株提高4%（3.09 vs 2.96 mol/mol），但残糖仍达1.8 g/L。随后经90代实验室进化，进化菌株IMM007的蔗糖-质子同向转运能力提升约10倍（达20.8 mmol g⁻¹ h⁻¹），残糖浓度降至0.1 g/L，乙醇产率进一步提高至3.30 mol/mol，较参考菌株提升11%，同时生物量降低30%。转录组分析揭示AGT1基因发生重复且表达上调，删除两个AGT1拷贝后表型恢复至参考水平，证实该基因是进化表型的关键。该工作首次证明将蔗糖水解定位至胞内可有效提升乙醇产率，为工业生物乙醇生产提供了可行的代谢工程策略。
创新点
首次证明将蔗糖水解从胞外转移到胞内可提高乙醇产率；结合进化工程改善蔗糖转运；鉴定AGT1的重复和上调是进化菌株表型的关键。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 蔗糖代谢 | SUC2 | 蔗糖酶 (invertase) | 催化 | 编码胞外和胞内蔗糖酶；工程改造后94%蔗糖酶定位在胞内。 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 蔗糖转运 | AGT1 | Agt1p α-葡萄糖苷-质子共转运体 | 转运 | 蔗糖-质子同向转运；进化菌株中基因重复且转录水平上调，删除后蔗糖转运能力下降。 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 蔗糖代谢/能量代谢 | PMA1 | Pma1p 质膜ATPase | 能量供给 | 负责泵出质子以维持质子梯度，消耗ATP，影响胞内水解途径的净ATP产量。 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 二糖转运 | MAL31 | MAL31p 麦芽糖通透酶 | 转运 | 进化菌株中表达上调，可能参与蔗糖转运。 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 二糖代谢 | MAL12/MAL32 | 麦芽糖酶 (α-葡萄糖苷酶) | 催化 | 编码胞内麦芽糖酶，进化菌株中表达上调，可能参与胞内蔗糖水解。 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 己糖转运 | HXT基因家族 | 己糖转运体 (Hxt) | 转运 | 介导葡萄糖和果糖的促进扩散，在胞外水解途径中起作用。 |
关键发现
- 理论预测胞内水解可使乙醇产率提高8.7%（约9%）；工程菌株iSUC2（IM1056）中94%的蔗糖酶定位到胞内，但乙醇产率仅提高4%（3.09 vs
- 96 mol/mol），残糖浓度1.8 g/L；经过90代实验室进化，残糖浓度从2 g/L降至0.1 g/L（20倍），蔗糖-质子同向转运能力从1.74提高到20.8 mmol g DW-1 h-1（约10倍）；进化菌株IMM007的乙醇产率提高11%（3.30 vs
- 96 mol/mol），生物量降低30%；AGT1发生重复且转录水平上调，删除两个AGT1拷贝后表型恢复至参考菌株水平。
研究结论
通过改变蔗糖代谢拓扑（胞内水解）可以显著提高乙醇产率，该策略在工业生物乙醇生产中具有应用前景。