Identification of bottlenecks in Escherichia coli engineered for the production of CoQ10
- 作者
- Corinne P. Cluis, Andrew Ekins, Lauren Narcross, Heng Jiang, Nicholas D. Gold, Adam M. Burja, Vincent J.J. Martin
- 单位
- Department of Biology, Concordia University; Ocean Nutrition Canada
- 杂志
- Metabolic Engineering（2011）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2011.09.009
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌中工程化生产辅酶Q10（CoQ10）时，识别限制产量和碳流通量的瓶颈，并通过系统改造提高CoQ10的积累。
研究策略
删除内源ispB基因并用来自Sphingomonas baekryungensis的癸异戊二烯二磷酸合酶（DPS）功能替代；过表达芳香族途径限速酶（tktA、aroFBR、aroB等）增加前体对羟基苯甲酸（PHB）的合成；异源表达合成甲羟戊酸操纵子增加异戊二烯前体；过表达来自Erythrobacter sp. NAP1的PHB癸异戊二烯转移酶（UbiA）以疏通泛醌途径下游瓶颈；系统分析中间产物积累以定位瓶颈。
核心内容
该研究通过系统改造大肠杆菌MG1655，识别并解除辅酶Q10（CoQ10）生产的多个瓶颈。作者删除内源ispB基因并以来自Sphingomonas baekryungensis的癸异戊二烯二磷酸合酶（DPS）替代，同时过表达芳香族途径限速酶（tktA、aroFBR、aroB等）和异源甲羟戊酸操纵子分别增强前体对羟基苯甲酸（PHB）和异戊二烯供给，并进一步过表达来自Erythrobacter sp. NAP1的PHB癸异戊二烯转移酶（UbiA）疏通下游。最优菌株CC2.DU.1.ARO3.ISO1的CoQ10含量达213 μg/L/OD600（约0.8 mg/g DCW），比仅表达DPS的对照提高3.2倍。过表达芳香族途径使PHB产量达13 mg/L/OD600，较对照提高220倍。产物分析首次报道了2-癸异戊二烯基苯酚（10P-Ph）和3-癸异戊二烯基-4-氨基苯甲酸（10P-AB）等异常中间体积累，提示UbiA底物混杂和前体化学计量失衡。尽管产量显著提升，仍仅达理论值的2%，表明DPS效率、UbiA毒性及下游酶活性构成新的瓶颈，该工作系统揭示了CoQ10过量生产中的限速环节并为后续优化指明方向。
创新点
['首次同时过表达并遗传解除芳香族和异戊二烯前体途径的调控，并组合过表达连接两条途径的UbiA酶，系统提高CoQ10产量。', '首次在大肠杆菌工程菌中报道2-癸异戊二烯基苯酚（10P-Ph）这一泛醌途径中间体的积累。', '首次报道过表达UbiA与增强异戊二烯合成时，UbiA以对氨基苯甲酸（PABA）为底物生成3-癸异戊二烯基-4-氨基苯甲酸（10P-AB），提示前体化学计量平衡的重要性。']
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 | 泛醌/辅酶Q生物合成、异戊二烯途径 | dps | decaprenyl diphosphate synthase (DPS) from Sphingomonas baekryungensis | 催化 | 密码子优化版本dps_o，功能替代内源IspB，催化合成癸异戊二烯二磷酸（DPP） |
| Escherichia coli MG1655 | 泛醌/辅酶Q生物合成、异戊二烯途径 | ispB | octaprenyl diphosphate synthase (IspB) | 催化 | 内源基因被删除，以消除CoQ8合成 |
| Escherichia coli MG1655 | 泛醌/辅酶Q生物合成 | ubiA | PHB decaprenyl transferase (UbiA) from Erythrobacter sp. NAP1 | 催化 | 密码子优化版本ubiA_o，催化PHB与DPP缩合生成10P-HB，过表达以缓解前体缩合瓶颈 |
| Escherichia coli MG1655 | 芳香族途径/泛醌前体PHB合成 | ubiC | chorismate lyase (UbiC) | 催化 | 催化分支酸转化为PHB；在染色体上被整合的LACC操纵子替换（ubiC::LLACC） |
| Escherichia coli MG1655 | 芳香族途径/磷酸戊糖途径 | tktA | transketolase A (TktA) | 催化 | 过表达以增加E4P供应，促进芳香族前体合成 |
| Escherichia coli MG1655 | 芳香族途径 | aroFBR | 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase (DAHPS) feedback-resistant mutant (AroFBR) | 催化 | 反馈抑制抗性突变体，解除酪氨酸反馈抑制，提高DAHP合成 |
| Escherichia coli MG1655 | 芳香族途径 | aroB | 3-dehydroquinate synthase (AroB) | 催化 | 过表达以增强芳香族途径碳流 |
| Escherichia coli MG1655 | 芳香族途径 | aroL | shikimate kinase I (AroL) | 催化 | 包含在下游芳香族操纵子LACC中，催化莽草酸磷酸化 |
| Escherichia coli MG1655 | 芳香族途径 | aroA | 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (AroA) | 催化 | 包含在下游芳香族操纵子LACC中 |
| Escherichia coli MG1655 | 芳香族途径 | aroC | chorismate synthase (AroC) | 催化 | 包含在下游芳香族操纵子LACC中 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲羟戊酸途径 | ERG12, ERG8, MVD1 | mevalonate kinase, phosphomevalonate kinase, mevalonate diphosphate decarboxylase from Saccharomyces cerevisiae | 催化 | 来自pMBIS质粒的下游甲羟戊酸操纵子，将外源甲羟戊酸转化为IPP/DMAPP |
| Escherichia coli MG1655 | 甲羟戊酸途径/异戊二烯途径 | idi | isopentenyl diphosphate isomerase (Idi) | 催化 | 来自大肠杆菌，催化IPP与DMAPP互变 |
| Escherichia coli MG1655 | 异戊二烯途径 | ispA | farnesyl diphosphate synthase (IspA) | 催化 | 来自大肠杆菌，催化FPP合成，为DPP提供底物 |
关键发现
- ['最优菌株CC2.DU.1.ARO3.ISO1的CoQ10含量达到213 μg/L/OD600，约为0.8 mg/g DCW，比仅表达DPS的对照菌株CC2.D.1提高3.2倍。', '过表达芳香族上游和下游操纵子（pALTAA和ubiC::LLACC）使PHB产量达到13 mg/L/OD600，较对照提高220倍
- SA产量达25 mg/L/OD600
- 在ΔaroKΔaroL背景下SA产量较对照提高20倍以上。', '单独表达甲羟戊酸操纵子（pMBIS）使CoQ10含量提高2倍（达123 μg/L/OD600）
- 同时过表达芳香族和异戊二烯途径使CoQ10达160 μg/L/OD600（2.6倍提高）。', '过表达UbiA后，CC2.DU.1.ARO3.ISO1的10P-Ph积累比CC2.D.1.ARO3.ISO1降低1.8倍，而CoQ10含量更高。', 'CC2.D.1.ARO3.ISO1中10P-Ph积累量是CC2.D.1.ISO1的14倍。', '过表达UbiA和甲羟戊酸途径的菌株CC2.DU.1.ISO1中检测到10P-AB（3-癸异戊二烯基-4-氨基苯甲酸）的积累，这是一种此前未在大肠杆菌CoQ10工程菌中报道的异常代谢物。']
研究结论
通过同时增强芳香族和异戊二烯前体合成以及过表达UbiA，可显著提高大肠杆菌CoQ10产量，但产量仅达理论值的2%，仍存在DPS效率、UbiA毒性、PHB向胞内供应、泛醌途径下游酶活性等多重瓶颈。该研究系统揭示了CoQ10过量生产中的新瓶颈，并为后续优化提供了方向。