Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering
- 作者
- Jay D. Keasling
- 单位
- Synthetic Biology Engineering Research Center, University of California, Berkeley, CA 94720, USA; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley, CA 94720, USA; Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, CA 94720, USA; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720, USA; Joint BioEnergy Institute, Emeryville, CA 94608, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2012）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2012.01.004
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
代谢工程缺乏标准化、可预测的生物学工具，导致生物系统开发时间长、成本高，需要合成生物学提供工具来加速代谢工程。
研究策略
以微生物生产抗疟药物青蒿素前体青蒿酸为例，系统阐述了合成生物学工具（底盘细胞、载体、启动子、多基因协同表达、计算机辅助设计、调试方法）在代谢工程中的应用，并展示了通过途径平衡、蛋白支架、靶向蛋白质组学等手段优化代谢通量。
研究路线图
核心内容
该研究系统阐述了合成生物学工具在代谢工程中的应用，并以微生物生产抗疟药物青蒿素前体青蒿酸为范例，展示了从底盘细胞改造到多基因协同表达、途径平衡及计算机辅助设计的完整策略。研究者在大肠杆菌中引入异源甲羟戊酸途径并密码子优化紫穗槐二烯合酶，使紫穗槐二烯产量超过27 g/L；利用mRNA二级结构控制基因表达使甲羟戊酸产量提高7倍；通过设计合成蛋白支架，将AtoB、HMGS和HMGR按1:2:2比例组装，使甲羟戊酸产量提高77倍。在酿酒酵母中，过表达截短型HMG-CoA还原酶使紫穗槐二烯产量提高约5倍，下调ERG9再提高2倍，组合优化后达到105 mg/L，额外整合tHMG使产量最终升至153 mg/L。表达青蒿酸氧化酶CYP71AV1及其氧化还原伴侣后，醇产物产量提高12倍至5.6 mg/L，实现青蒿酸全氧化生产。该研究还通过底盘工程、靶向蛋白质组学鉴定限速酶等手段优化代谢通量，证明合成生物学持续开发标准化工具是降低代谢工程时间和成本的最可靠途径，这些工具虽不如具体问题解决方案引人注目，但能支撑众多应用。
创新点
提出利用mRNA二级结构控制基因表达、合成蛋白支架将酶锚定以增加底物通道、靶向蛋白质组学鉴定限速酶、以及通过底盘工程（如下调ERG9、过表达tHMG）提高异源类异戊二烯产量等方法。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（外源） | atoB (乙酰乙酰辅酶A硫解酶) | AtoB | 催化 | MevT操作子第一个酶，将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（外源） | HMGS (来自Saccharomyces cerevisiae) | HMG-CoA synthase | 催化 | MevT操作子第二个酶，将乙酰乙酰辅酶A转化为HMG-CoA |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（外源） | HMGR (来自Saccharomyces cerevisiae) | HMG-CoA reductase | 催化 | MevT操作子第三个酶，将HMG-CoA转化为甲羟戊酸 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（外源） | MVK (来自Saccharomyces cerevisiae) | mevalonate kinase | 催化 | MBIS操作子，将甲羟戊酸磷酸化 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（外源） | PMK (来自Saccharomyces cerevisiae) | phosphomevalonate kinase | 催化 | MBIS操作子，将甲羟戊酸磷酸盐进一步磷酸化 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（外源） | PMD (来自Saccharomyces cerevisiae) | mevalonate diphosphate decarboxylase | 催化 | MBIS操作子，将甲羟戊酸二磷酸脱羧形成IPP |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（外源） | idi (来自Escherichia coli) | isopentenyl pyrophosphate isomerase | 催化 | MBIS操作子，将IPP异构化为DMAPP |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（外源） | ispA (来自Escherichia coli) | FPP synthase | 催化 | MBIS操作子，将IPP和DMAPP缩合生成FPP |
| Escherichia coli | 青蒿素前体生物合成 | ADS (来自Artemisia annua) | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 将FPP环化为紫穗槐二烯 |
| Escherichia coli | 青蒿素前体生物合成 | CYP71AV1 (来自Artemisia annua) | cytochrome P450 monooxygenase (amorphadiene oxidase) | 催化 | 三步氧化紫穗槐二烯为青蒿酸 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（外源） | — | 合成蛋白支架 (GBD-SH3-PDZ domains) | 调控 | 将AtoB、HMGS、HMGR锚定在支架上，优化比例（1:2:2）使甲羟戊酸产量提高77倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 (截短的HMG-CoA还原酶) | 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (truncated soluble form) | 催化 | 过表达使紫穗槐二烯产量提高约5倍；整合额外拷贝再提高50% |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇生物合成途径 | ERG9 | squalene synthase | 催化 | 通过甲硫氨酸抑制型启动子PMET3下调其表达，使紫穗槐二烯产量额外提高2倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇生物合成调控 | UPC2 (等位基因upc2-1) | UPC2 (global transcription factor) | 调控 | 半显性突变等位基因，增强甾醇生物合成相关基因表达，与ERG9下调组合使产量达105 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | ERG20 | FPP synthase | 催化 | 过表达对总产量影响小，但比产量提高约10% |
| Saccharomyces cerevisiae | 丙酮酸脱氢酶旁路 | ALD6 (或内源乙醛脱氢酶) | acetaldehyde dehydrogenase | 催化 | 过表达增加乙酰辅酶A供应 |
| Saccharomyces cerevisiae | 丙酮酸脱氢酶旁路 | ACS* (来自Salmonella enterica的乙酰辅酶A合成酶变体) | acetyl-CoA synthetase variant | 催化 | 引入该变体增加乙酰辅酶A合成，提高青蒿素前体产量 |
关键发现
- 在大肠杆菌中，通过异源甲羟戊酸途径和密码子优化的紫穗槐二烯合酶，紫穗槐二烯产量超过27 g/L
- 通过mRNA二级结构控制使甲羟戊酸产量提高7倍
- 通过合成蛋白支架（1个AtoB、2个HMGS、2个HMGR）使甲羟戊酸产量提高77倍
- 在酿酒酵母中，过表达截短型HMG-CoA还原酶使紫穗槐二烯产量提高约5倍，下调ERG9再提高2倍，组合优化后达到105 mg/L，额外整合tHMG使产量提高50%至149 mg/L，最终达到153 mg/L
- 表达青蒿酸氧化酶CYP71AV1及其氧化还原伴侣后，醇产物产量从0.18–0.45 mg/L提高12倍至5.6 mg/L，最终实现青蒿酸的全氧化生产
- 大肠杆菌紫穗槐二烯产量在数年内提高超过一百万倍。
研究结论
合成生物学持续开发标准化生物学工具是降低代谢工程时间和成本的最可靠途径，虽然工具开发不如具体问题解决方案引人注目，但能支撑众多应用。