Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for bioconversion of D-xylose to D-xylonate
- 作者
- Mervi Toivari, Yvonne Nygard, Esa-Pekka Kumpula, Maija-Leena Vehkomäki, Mojca Benčina, Mari Valkonen, Hannu Maaheimo, Martina Andberg, Anu Koivula, Laura Ruohonen, Merja Penttilä, Marilyn G. Wiebe
- 单位
- VTT, Technical Research Centre of Finland, PO Box 1000, FI-02044 VTT, Espoo, Finland; Department of Biotechnology, National Institute of Chemistry, Hajdrihova 19, SI-1000 Ljubljana, Slovenia; Excellent NMR—Future Innovation for Sustainable Technologies Centre of Excellence, Ljubljana, Slovenia
- 杂志
- Metabolic Engineering（2012）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2012.03.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用酿酒酵母将D-木糖生物转化为D-木糖酸，解决现有酵母中D-木糖脱氢酶活性低、NADPH再生效率差、木糖醇副产物多等问题，实现高效生产。
研究策略
将来自新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)的NAD+依赖D-木糖脱氢酶基因xylB在酿酒酵母中表达，并与来自里氏木霉(T. reesei)的xyd1和猪肝的SUS2DD等NADP+依赖脱氢酶比较；通过删除醛糖还原酶基因GRE3减少木糖醇副产物；引入D-木糖酸内酯酶基因xylC促进内酯水解；在工业菌株B67002中整合xylB基因以提高产量。
核心内容
本研究在酿酒酵母中构建了D-木糖到D-木糖酸的高效生物转化途径。研究者将新月柄杆菌来源的NAD+依赖性D-木糖脱氢酶基因xylB在酵母中表达，并与里氏木霉xyd1和猪肝SUS2DD等NADP+依赖酶进行比较，同时通过删除醛糖还原酶基因GRE3减少副产物木糖醇，并引入D-木糖酸内酯酶基因xylC促进内酯水解。结果表明，表达xylB的CEN.PK菌株在含23 g/L D-木糖和9 g/L D-葡萄糖的条件下产生17 g/L D-木糖酸，产量和速率分别比NADP+依赖酶菌株高约5倍和10倍；删除GRE3使木糖醇产量从2.7 g/L降至0.5 g/L，降低约80%。在工业菌株B67002中整合xylB后，从49 g/L D-木糖获得43 g/L D-木糖酸，初始生产速率达0.44 g/L/h。纯化的XylB对D-木糖高度特异，Km为0.08–0.40 mM，对L-阿拉伯糖的特异性常数低400–600倍。该研究证实NAD+依赖的XylB是酵母中高效转化D-木糖的关键酶，但生产速率仍低于细菌，且产物积累导致细胞活力下降，需进一步优化产物外排和能量代谢。
创新点
首次在酿酒酵母中采用NAD+特异性的新月柄杆菌XylB脱氢酶，D-木糖酸产量和速率比NADP+依赖酶提高约5倍和10倍；通过删除GRE3和表达XylC内酯酶优化生产；在工业菌株中实现43 g/L的D-木糖酸产量。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-17A | D-木糖氧化途径 | xylB | XylB | 催化 | NAD+依赖的D-木糖脱氢酶，来自Caulobacter crescentus，催化D-木糖氧化为D-木糖酸内酯 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-17A | D-木糖氧化途径 | xylC | XylC | 催化 | D-木糖酸内酯酶，来自Caulobacter crescentus，催化D-木糖酸内酯水解为D-木糖酸 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-17A gre3Δ | D-木糖还原途径（副产物代谢） | GRE3 | Gre3p | 催化 | 醛糖还原酶，催化D-木糖还原为木糖醇，本文将其删除以减少副产物木糖醇的积累 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-17A | D-木糖氧化途径 | xyd1 | Xyd1 | 催化 | NADP+依赖的D-木糖脱氢酶，来自Trichoderma reesei，用于对比研究 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-17A | D-木糖氧化途径 | SUS2DD | SUS2DD | 催化 | NADP+依赖的D-木糖脱氢酶，来自猪肝，用于对比研究 |
| Saccharomyces cerevisiae B67002 | D-木糖氧化途径 | xylB | XylB | 催化 | 工业菌株，通过整合两个拷贝xylB实现43 g/L D-木糖酸生产 |
关键发现
- 表达xylB的CEN.PK菌株在含23±1 g/L D-木糖、9±1 g/L D-葡萄糖并补加乙醇的条件下，产生17±2 g/L D-木糖酸，生产速率0.23±0.02 g/L/h，产量比表达xyd1或SUS2DD的菌株高5倍以上，速率高10倍。工业菌株B67002表达xylB从49 g/L D-木糖产生43±1 g/L D-木糖酸，初始生产速率0.44±0.01 g/L/h。细胞内D-木糖酸积累可达约70 mg/g干重（CEN.PK）和约170 mg/g（工业菌株）。删除GRE3使木糖醇产量降低约80%，从2.7 g/L降至0.5 g/L。表达xylC内酯酶在pH 3时提高D-木糖酸产量（xylB xylC
- 7±1.1 g/L vs xylB
- 5±0.9 g/L）。纯化的XylB对D-木糖高度特异，Km为0.08-0.40 mM，kcat为1360-1820 min-1，对L-阿拉伯糖的特异性常数低400-600倍。细胞活力在D-木糖酸产生过程中显著下降，pH 3时更严重，胞内pH从7.5降至7.2。
研究结论
表达NAD+依赖的新月柄杆菌XylB使酿酒酵母高效转化D-木糖为D-木糖酸，工业菌株产量超过40 g/L，但生产速率仍低于细菌（约1.7 g/L/h），需进一步优化产物外排、能量代谢和细胞活力维持。