Carotenoid-based phenotypic screen of the yeast deletion collection reveals new genes with roles in isoprenoid production
- 作者
- Bilge Özaydın, Helcio Burd, Taek Soon Lee, Jay D. Keasling
- 单位
- Joint BioEnergy Institute, Emeryville, CA 94608, USA; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720, USA; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley, CA 94720, USA; Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, CA 94720, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2012）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2012.07.010
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酵母中异戊二烯类化合物（如类胡萝卜素、双没药烯）的产量有限，已知的甲羟戊酸途径改造已接近瓶颈，需要寻找新的、非途径基因的靶点来提高前体供给和产量。
研究策略
以类胡萝卜素为可视化表型，将来自Xanthophyllomyces dendrorhous的类胡萝卜素合成基因导入酵母单倍体缺失库，高通量筛选颜色增强的缺失菌株；随后在候选菌株中表达双没药烯合酶，结合甲羟戊酸途径的模块化改造（tHMG1、ERG20融合、ERG9下调）和发酵优化，提高双没药烯产量。
核心内容
该研究以类胡萝卜素为可视化报告，将来自红法夫酵母的类胡萝卜素合成基因导入酵母单倍体缺失库，对5000余株缺失菌株进行高通量颜色筛选，共鉴定出156株类胡萝卜素含量显著增强的菌株，其中arp6、erg24等五株缺失株的类胡萝卜素含量约为亲本的4倍。随后在CEN.PK2背景下，将候选基因缺失与甲羟戊酸途径工程结合，通过过表达tHMG1、ERG20融合双没药烯合酶及下调ERG9等方式，显著推动代谢流朝双没药烯方向汇聚。结果显示，rox1缺失使双没药烯产量从200 mg/L提升至约400 mg/L，yjl064w与ypl062w双缺失菌株平均产量达540 mg/L，摇瓶最高可达800 mg/L；补料分批发酵中经24小时延长培养，产量由3.2 g/L升至5.2 g/L。该工作表明，全基因组表型筛选能有效发掘非途径基因缺失靶点，与经典途径改造叠加后可大幅提升异戊二烯类化合物的产量，同时揭示萜烯合酶自身催化效率仍是进一步增产的关键限制因素。
创新点
1. 首次利用类胡萝卜素表型对酵母全基因组缺失库进行系统筛选，识别出新的影响异戊二烯产量的基因缺失；2. 发现ROX1、YJL064W、YPL062W等非典型途径基因的缺失可显著提高双没药烯产量；3. 将ERG20与双没药烯合酶融合表达，既提高了融合蛋白表达量又使产量翻倍；4. 通过组合基因缺失和pathway工程，实现摇瓶水平800 mg/L、发酵罐5.2 g/L的双没药烯产量。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母BY4741 | 类胡萝卜素合成 | crtYB | 八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶（双功能） | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，构建类胡萝卜素可视化筛选系统 |
| 酿酒酵母BY4741 | 类胡萝卜素合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，与crtYB共同产生类胡萝卜素 |
| 酿酒酵母BY4741 | 类胡萝卜素合成 | BTS1 | 香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPP合酶） | 催化 | 天然GGPP合酶，额外拷贝可解除类胡萝卜素合成瓶颈 |
| 酿酒酵母BY4741 | 类胡萝卜素合成 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous的GGPP合酶同源物，用于对照 |
| 酿酒酵母CEN.PK2 | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短HMG-CoA还原酶（催化域） | 催化 | 过表达可提高甲羟戊酸途径通量，绕过负反馈调节 |
| 酿酒酵母CEN.PK2 | 甲羟戊酸途径/双没药烯合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶（FPP合酶） | 催化 | 与AgBIS融合表达（B~E）提高产量和蛋白稳定性 |
| 酿酒酵母CEN.PK2 | 双没药烯合成 | AgBIS | 双没药烯合酶 | 催化 | 来自Abies grandis，经密码子优化；催化FPP生成双没药烯 |
| 酿酒酵母CEN.PK2 | 麦角固醇合成 | ERG9 | 角鲨烯合酶 | 催化 | 启动子替换为CYC1弱启动子以削弱竞争分支，增加FPP流向目标产物 |
| 酿酒酵母CEN.PK2 | 甲羟戊酸途径/麦角固醇合成调控 | ROX1 | 转录因子Rox1 | 调控 | 缺失后解除对甲羟戊酸途径和麦角固醇合成基因的抑制，产量提高2倍 |
| 酿酒酵母CEN.PK2 | 未明（可能影响碳代谢） | YJL064W | 未知功能蛋白 | 调控 | 未知功能基因，缺失增加类胡萝卜素和双没药烯产量，推测增加途径通量 |
| 酿酒酵母CEN.PK2 | 未明（可能影响碳代谢） | YPL062W | 未知功能蛋白 | 调控 | 未知功能，缺失菌株糖原含量低，可能释放乙酰-CoA进入甲羟戊酸途径 |
| 酿酒酵母CEN.PK2 | 蛋白降解 | PRB1 | 液泡蛋白酶B | 调控 | 缺失在BY4741背景中提高双没药烯产量，但在CEN.PK2中效果不明显 |
| 酿酒酵母CEN.PK2 | GAL调控 | GAL80 | 半乳糖转录抑制因子 | 调控 | 缺失使GAL启动子成为组成型，避免使用半乳糖作为诱导剂 |
关键发现
- 从5000多个缺失菌株中筛出156个类胡萝卜素显著增强的菌株，其中arp6、erg24、ser33、ydr215c、ypl062w的类胡萝卜素含量较亲本提高约4倍
- 在24个高类胡萝卜素菌株中，只有rox1、prb1、yjl064w、ypl062w对双没药烯有适度提高
- tHMG1过表达使双没药烯产量提高2倍，额外过表达ERG20再提高25%，ERG20与AgBIS融合使产量近2倍
- 在CEN.PK2背景下，rox1缺失使双没药烯从200 mg/L升至约400 mg/L，组合缺失达到450 mg/L
- yjl064w ypl062w双缺失菌株（JBEI4732/pRS-AgBIS）平均产量540 mg/L
- 摇瓶6天最高产量800 mg/L
- 在补料分批发酵中继续培养24小时后产量由3.2 g/L增至5.2 g/L。
研究结论
系统筛选揭示了新的基因缺失靶点，结合途径工程可实现异戊二烯化合物（双没药烯）的高产（摇瓶800 mg/L、发酵5.2 g/L），表明酵母具有进一步提升异戊二烯生产的潜力；但萜烯合酶的催化效率仍是限制因素，需进一步改造。