Quantitative trait analysis of yeast biodiversity yields novel gene tools for metabolic engineering
- 作者
- Georg Hubmann, Maria R. Foulquié-Moreno, Elke Nevoigt, Jorge Duitama, Nicolas Meurens, Thiago M. Pais, Lotte Mathé, Sofie Saerens, Huyen Thi Thanh Nguyen, Steve Swinnen, Kevin J. Verstrepen, Luigi Concilio, Jean-Claude de Troostemberg, Johan M. Thevelein
- 单位
- Laboratory of Molecular Cell Biology, Institute of Botany and Microbiology, KU Leuven, and Department of Molecular Microbiology, VIB, Kasteelpark Arenberg 31, B-3001 Leuven-Heverlee, Flanders, Belgium; School of Engineering and Science, Jacobs University Bremen, Campus Ring 1, 28759 Bremen, Germany; Laboratory for Genetics and Genomics, Centre of Microbial and Plant Genetics (CMPG), KU Leuven, Kasteelpark Arenberg 22, B-3001 Leuven-Heverlee, Belgium; Laboratory for Systems Biology, VIB, Bio-Incubator, Gaston Geenslaan 1, B-3001 Leuven-Heverlee, Belgium; Cargill R&D Centre Europe, Havenstraat 84, B-1800 Vilvoorde, Belgium; Present address: Wine Innovation Department, Cultures and Enzymes Division, Chr. Hansen A/S, 10-12 Bøge Allé, DK-2970 Hørsholm, Denmark
- 杂志
- Metabolic Engineering（2013）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2013.02.006
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在工业酵母发酵中，降低甘油产量以提高乙醇产率，同时避免损害生长速率、体积生产率和渗透压耐受性；并鉴定可用于反向代谢工程的新基因工具。
研究策略
通过筛选酵母菌株多样性获得低甘油产量菌株CBS6412，与工业菌株Ethanol Red杂交构建分离子群体，利用池化分离子全基因组测序进行QTL定位，结合反向半合子分析和等位基因互换验证因果基因，最终将突变等位基因引入工业菌株以验证其应用价值。
核心内容
该研究利用酵母天然多样性解析低甘油产量这一代谢数量性状的遗传基础，并从中挖掘可用于反向代谢工程的基因工具。研究者从52株酵母中筛选出甘油产量最低的菌株CBS6412（0.043 g·g⁻¹，约为工业菌株Ethanol Red的63%），将其与工业菌株杂交后从257个分离子中挑选20个最优个体进行池化全基因组测序，成功定位到染色体XII上的一个主要QTL。通过反向半合子分析与等位基因互换，鉴定出因果基因为SSK1中一个因单碱基缺失导致移码的截短等位基因（ssk1^E330N...K356N，编码356个氨基酸，野生型为712个）。将该等位基因双插入工业菌株Ethanol Red后，甘油产量相对对照从167%降至128%，解释了该性状50–60%的效应，且不损害最大生长速率（ssk1Δ敲除株生长速率由0.47 h⁻¹降至0.35 h⁻¹，而该等位基因无此缺陷），在高渗条件下仍保持甘油/乙醇比改善和体积生产率不受额外影响。该工作首次对非选择性代谢性状进行多基因定位，证明了从天然酵母多样性中发掘优于传统基因敲除的代谢工程新基因工具的可行性，为工业菌株改良提供了新策略。
创新点
首次对非选择性的代谢数量性状（甘油产量）进行多基因分析，仅用20个优良分离子成功定位QTL；鉴定出一个截短且部分错译的SSK1等位基因（ssk1^E330N...K356N），该等位基因相比SSK1敲除能更有效地降低甘油/乙醇比，且对生长、体积生产率和渗透压耐受性的副作用更小；展示了从天然酵母多样性中发掘代谢工程新基因工具的方法。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (industrial strain Ethanol Red and its derivatives HG5, HG7, HG8) | 甘油合成与乙醇发酵 / HOG信号通路 | SSK1 (wild-type), ssk1^E330N...K356N, ssk1Δ | Ssk1 | 调控 | HOG通路中的响应调节蛋白，突变等位基因降低甘油产量并提高乙醇产量，且比基因敲除副作用小。 |
| Saccharomyces cerevisiae (strain CBS6412 and its segregant CBS4C) | 甘油合成与乙醇发酵 / HOG信号通路 | SSK1 (ssk1^E330N...K356N) | Ssk1 | 调控 | CBS6412中该突变等位基因纯合，是其低甘油表型的主要原因。 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甘油合成 | GPD1, GPD2, GPP1, GPP2 | NAD+依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶，甘油-3-磷酸磷酸酶 | 催化 | 文中作为甘油合成的关键酶提及，但未直接进行基因操作。 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甘油转运 | FPS1 | Fps1 | 转运 | 质膜甘油通道蛋白，调控甘油的保留与外排。 |
关键发现
- 从52株酵母中筛选出CBS6412甘油产量最低（0.043 g·g^-1），约为工业菌株Ethanol Red（0.068 g·g^-1）的63%
- 在257个分离子中选取20个最优分离子进行池化测序，定位到染色体XII上的主要QTL（135-200 kb），最小P值为9×10^-11
- SSK1等位基因因单碱基缺失导致移码，在第357位引入终止密码子，产生截短蛋白（356 aa，野生型为712 aa）
- 在Ethanol Red中双插入ssk1^E330N...K356N使甘油产量相对CBS4C从167%降至128%，即该突变解释了该性状50-60%的效应
- 在CBS4C背景中，ssk1Δ的最大生长速率为0.35 h^-1，而原株为0.47 h^-1，但ssk1^E330N...K356N无此生长缺陷
- 在最小培养基中，Ethanol Red突变株的乙醇产量明显增加
- 在高渗条件下（0.7-1 M NaCl或1.4-2 M山梨醇），携带突变等位基因的菌株仍保持甘油/乙醇比的改善，且最大体积乙醇生产率未受额外影响。
研究结论
酵母生物多样性的定量性状分析能够为代谢工程提供优于传统基因敲除的新基因工具。ssk1^E330N...K356N等位基因在工业菌株Ethanol Red中可有效降低甘油产量并提高乙醇产量，且对生长、体积生产率和渗透压耐受性的负面影响小于SSK1基因敲除，具有应用于工业生物乙醇生产的潜力。