Characterization of two geraniol syntheses from Valeriana officinalis and Lippia dulcis: Similar activity but difference in subcellular localization
- 作者
- Lemeng Dong, Karel Miettinen, Miriam Goedbloed, Francel W.A. Verstappen, Alessandra Voster, Maarten A. Jongsma, Johan Memelink, Sander van der Krol, Harro J. Bouwmeester
- 单位
- Laboratory of Plant Physiology, Wageningen UR, P.O. Box 658, 6700 AR Wageningen, The Netherlands; Institute of Biology, Sylvius Laboratory, Leiden university, P.O. Box 9505, 2300 RA Leiden, The Netherlands; Plant Research International, Wageningen UR, P.O. Box 619, 6700 AP Wageningen, The Netherlands
- 杂志
- Metabolic Engineering（2013）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2013.09.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在异源宿主中高效生产单萜香叶醇，作为重建萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径中单萜环烯醚萜分支的第一步；同时解析来自缬草（VoGES）和甜舌草（LdGES）两个香叶醇合酶的不同亚细胞定位及其对体内活性的影响。
研究策略
克隆并异源表达VoGES和LdGES，通过体外酶学测定比较Km和产物；在烟草和本氏烟草中瞬时/稳定表达，利用GFP融合和截短突变研究亚细胞定位；通过GC-MS和LC-MS分析香叶醇及其氧化和糖基化产物，评估底物可及性和内源代谢分流。
核心内容
该研究克隆并功能表征了来自缬草（VoGES）和甜舌草（LdGES）的两个香叶醇合酶，旨在为在烟草中重建萜类吲哚生物碱（TIA）途径提供单萜环烯醚萜分支的前体。体外酶学测定显示两者均以GPP为专一底物，Km值分别为32 μM和51 μM。GFP融合及截短突变表明VoGES定位于质体而LdGES主要分布于细胞质，但在本氏烟草瞬时表达中两者香叶醇积累量相近（47.82 vs 45.10 μg/g鲜重），证明胞质中GPP底物足以支持单萜合成，截短型胞质定位仅使糖基化产物比质体型低30%。研究系统鉴定了香叶醇在烟草中的19种糖基化衍生物及氧化产物，叶片中糖基化香叶醇约32 μg/g鲜重，比花中高约5倍。稳定转化体中香叶醇释放速率显著低于瞬时表达（0.05 vs 0.58 μg/g鲜重每小时），且幼叶释放速率约为老叶的11倍。结果表明异源宿主内源氧化和糖基化酶会大量分流香叶醇，重建多步TIA途径时需通过组织特异性表达、共表达下游酶或抑制竞争反应来提高产量。
创新点
['首次报道VoGES的克隆与功能表征', '发现LdGES主要定位于细胞质而VoGES定位于质体，但两者体内活性相似', '证明胞质中GPP底物足以支持香叶醇合成（截短胞质型产量仅比质体型低30%）', '系统鉴定了香叶醇在烟草中的19种糖基化衍生物及组织特异性糖基化模式']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 单萜生物合成 | ΔNVoGES | VoGES | 催化 | 体外酶学表征，Km=32 μM，以GPP为底物 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 单萜生物合成 | ΔNLdGES | LdGES | 催化 | 体外酶学表征，Km=51 μM，以GPP为底物 |
| Nicotiana benthamiana | 单萜生物合成 | VoGES | VoGES | 催化 | 瞬时表达，质体定位，香叶醇积累47.82 μg/g fw |
| Nicotiana benthamiana | 单萜生物合成 | LdGES | LdGES | 催化 | 瞬时表达，胞质为主定位，香叶醇积累45.10 μg/g fw |
| Nicotiana tabacum 'Samsun NN' | 单萜生物合成 | VoGES | VoGES | 催化 | 稳定转化，叶片和花释放香叶醇，叶中糖基化产物32.04 μg/g fw |
| Nicotiana tabacum 'Samsun NN' | 单萜生物合成 | LdGES | LdGES | 催化 | 稳定转化，与VoGES活性相似 |
| Nicotiana benthamiana | 单萜生物合成 | VoGES-GFP | VoGES-GFP | 区室化 | GFP融合显示质体定位，可见基质丝 |
| Nicotiana benthamiana | 单萜生物合成 | LdGES-GFP | LdGES-GFP | 区室化 | GFP融合显示胞质定位，质体输入受损 |
| Nicotiana benthamiana | 单萜生物合成 | ΔNVoGES-GFP | ΔNVoGES-GFP | 区室化 | 缺失质体信号，胞质定位，产量比质体靶向低30% |
| Nicotiana benthamiana | 单萜生物合成 | ΔNLdGES-GFP | ΔNLdGES-GFP | 区室化 | 缺失质体信号，胞质定位，产量比质体靶向低30% |
| Nicotiana benthamiana | 单萜生物合成 | pΔNVoGES | pΔNVoGES | 区室化 | 融合人工质体转运肽，恢复质体靶向，产量较高 |
| Nicotiana benthamiana | 单萜生物合成 | pΔNLdGES | pΔNLdGES | 区室化 | 融合人工质体转运肽，恢复质体靶向，产量较高 |
关键发现
- ['VoGES和LdGES对GPP的Km分别为32 μM和51 μM，且均以GPP为专一底物，不利用FPP', '在本氏烟草瞬时表达中，VoGES和LdGES的香叶醇积累量相近（47.82±5.14 vs 45.10±10.24 μg/g fw），LdGES-GFP为72.07±17.55 μg/g fw', '稳定转化烟草中，VoGES和LdGES的最高产线香叶醇释放量相似，PC1解释49.7%代谢差异但未区分两者', '叶片中糖基化香叶醇产物约32.04 μg/g fw，花中仅6.39 μg/g fw，叶比花高约5倍', '截短型胞质定位VoGES/LdGES产生的香叶醇糖苷比质体靶向型低30%', '香叶醇在烟草中被内源酶转化为至少19种糖基化产物，约11%被氧化为羟基香叶醇、香叶酸、羟基香叶酸等', '瞬时空表达香叶醇产量约0.58 μg/g fw/h，稳定转化体约0.05 μg/g fw/h
- 叶片释放速率从幼叶55 ng/g h降至老叶5 ng/g h，盛开期花释放28 ng/g h']
研究结论
VoGES和LdGES虽然亚细胞定位不同（质体 vs 胞质），但在植物体内具有相似的香叶醇合成活性，说明胞质中GPP底物可支持单萜合成。异源宿主的内源氧化和糖基化酶会大量分流香叶醇，因此重建多步TIA途径时需通过组织特异性表达、共表达下游酶或抑制竞争反应来提高目标产物产量。