Energetic benefits and rapid cellobiose fermentation by Saccharomyces cerevisiae expressing cellobiose phosphorylase and mutant cellodextrin transporters
- 作者
- Suk-Jin Ha, Jonathan M. Galazka, Eun Joong Oh, Vesna Kordić, Heejin Kim, Yong-Su Jin, Jamie H.D. Cate
- 单位
- Department of Food Science and Human Nutrition, University of Illinois at Urbana-Champaign; Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign; Department of Molecular and Cell Biology, University of California at Berkeley; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory
- 杂志
- Metabolic Engineering（2012）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2012.11.005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中实现快速纤维二糖发酵，并比较磷酸化途径和水解途径的能量效率，解决磷酸化途径因热力学不利导致发酵速率慢的问题。
研究策略
在酿酒酵母中共表达纤维二糖磷酸化酶（CBP）和纤维糊精转运蛋白（CDT-1），通过进化工程筛选出高转运速率的CDT-1突变体（F213L），利用上游转运反应提供热力学“推动”以克服细胞二糖磷酸化的正ΔG，并与水解途径进行生理和能量比较。
核心内容
该研究在酿酒酵母中构建纤维二糖磷酸化途径，共表达纤维二糖磷酸化酶（CBP）和纤维糊精转运蛋白（CDT-1），并通过进化工程获得高转运速率的CDT-1突变体（F213L）。F213L突变通过提高胞内纤维二糖浓度，为热力学不利的磷酸化反应（ΔG°=+3.6 kJ/mol）提供“推动力”，从而克服反应能垒。工程菌株的纤维二糖消耗速率达1.72 g/L·h，乙醇生产速率0.74 g/L·h，较野生型转运蛋白菌株分别提高249%和290%，乙醇得率从0.37 g/g提升至0.44 g/g。在严格厌氧条件下，磷酸化菌株生物量比水解菌株高44%，纤维二糖消耗和乙醇产量高32–35%；连续培养时生物量高28–35%。每分子纤维二糖经磷酸化途径产生5 ATP，优于水解途径的4 ATP。该策略使酵母在保持高发酵速率的同时获得更高生物量和乙醇得率，尤其在厌氧或ATP受限条件下优势显著，F213L突变提供的高效转运是释放磷酸化途径能量优势的关键。
创新点
首次证明纤维二糖磷酸化途径在酵母中的能量优势，并发现通过突变转运蛋白（F213L）提高细胞内纤维二糖浓度可有效推动不利的磷酸化反应；工程菌株实现了与水解途径相当的快速发酵速率，且在厌氧和乙酸胁迫条件下表现出更高的生物量和乙醇产量。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖磷酸化途径 | cdt-1 | CDT-1 | 转运 | 来自粗糙脉孢菌的纤维糊精转运蛋白，野生型 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖磷酸化途径 | cdt-1 (F213L) | CDT-1 F213L | 转运 | 进化筛选获得的突变体，Vmax显著提高，KM增加至0.1888 mM |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖磷酸化途径 | SdCBP | SdCBP | 催化 | 来自解糖栖热菌的纤维二糖磷酸化酶，催化纤维二糖磷酸解为葡萄糖和Glc-1P |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖磷酸化途径 | CgCBP | CgCBP | 催化 | 来自纤维弧菌的纤维二糖磷酸化酶 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖磷酸化途径 | CtCBP | CtCBP | 催化 | 来自嗜热梭菌的纤维二糖磷酸化酶 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维糊精磷酸化途径 | ClCDP | ClCDP | 催化 | 来自梭菌属的纤维糊精磷酸化酶，可分解纤维三糖和纤维四糖 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖水解途径 | gh1-1 | GH1-1 | 催化 | 来自粗糙脉孢菌的胞内β-葡萄糖苷酶，水解纤维二糖为葡萄糖 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 糖酵解/磷酸化途径 | PGM2 | Pgm2 | 催化 | 磷酸葡萄糖变位酶，将Glc-1P转化为Glc-6P |
关键发现
- 表达CDT-1(F213L)和SdCBP的菌株纤维二糖消耗速率达1.72±0.11 g/L·h，乙醇生产速率0.74±0.05 g/L·h（0.25±0.02 g/g cell·h），比野生型转运蛋白菌株分别提高249%和290%
- 乙醇得率由0.37 g/g提升至0.44 g/g。在严格厌氧条件下，磷酸化菌株（CM p）的生物量比水解菌株（CM H）高44%，纤维二糖消耗和乙醇产量高32–35%
- 连续培养（稀释率0.06 h⁻¹）时磷酸化菌株生物量比水解菌株高28–35%。发酵80 g/L纤维二糖约36小时完成。GH1-1的K_M为0.32 mM，SdCBP的K_M为0.65 mM，二者kcat均约7 s⁻¹。细胞二糖磷酸化反应ΔG°=+3.6 kJ/mol，磷酸化途径每分子纤维二糖产生5 ATP，水解途径仅4 ATP。
研究结论
纤维二糖磷酸化途径在能量上优于水解途径，尤其适用于厌氧或ATP受限条件；但其正ΔG°（+3.6 kJ/mol）需要高速度的纤维二糖转运（如CDT-1 F213L突变）提供热力学“推动”才能实现快速发酵。该策略使工程酵母在保持高发酵速率的同时获得更高的生物量和乙醇得率，并减少纤维糊精积累。