Transient production of artemisinin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua
- 作者
- Bo Wang, Arman Beyraghdar Kashkooli, Adrienne Sallets, Hieng-Ming Ting, Norbert C.A. de Ruijter, Linda Olofsson, Peter Brodelius, Mathieu Pottier, Marc Boutry, Harro Bouwmeester, Alexander R. van der Krol
- 单位
- Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University, Droevendaalsesteeg 1, 6708 PB Wageningen, The Netherlands; Institut des Sciences de la Vie, Université catholique de Louvain, Croix du Sud, 4-5, Box L7.07.14, 1348 Louvain-la-Neuve, Belgium; Laboratory of Cell Biology, Wageningen University, Droevendaalsesteeg 1, 6708 PB Wageningen, The Netherlands; Department of Chemistry and Biomedical Sciences, Linnaeus University, SE-38192 Kalmar, Sweden
- 杂志
- Metabolic Engineering（2016）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2016.07.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
本氏烟异源表达青蒿素生物合成通路时，中间产物大量被内源糖基化酶修饰，游离的青蒿酸/二氢青蒿酸积累极低，终产物青蒿素/青蒿素B几乎无法生成；对萜类产物运输与区室化机制的认识不足，限制了异源生产高价值萜烯的效率。
研究策略
从黄花蒿中克隆三个腺毛表达的脂质转运蛋白基因（AaLTP1/2/3）和两个PDR型ABC转运蛋白基因（AaPDR1/2），在本氏烟叶片中瞬时共表达青蒿素全通路基因与候选转运/滞留蛋白，比较总提取物与质外体中的产物积累，并通过外源青蒿酸排阻实验鉴定出最有效的AaLTP3与AaPDR2组合。
核心内容
本研究从黄花蒿中克隆了三个腺毛特异性脂质转运蛋白基因（AaLTP1-3）与两个PDR型ABC转运蛋白基因（AaPDR1/2），并在本氏烟叶片中与青蒿素全合成通路基因瞬时共表达，考察产物在总提取物和质外体中的积累差异。结果表明，共表达AaLTPs与AaPDRs可使叶片中青蒿酸含量增加2.1倍、二氢青蒿酸相对水平提升3.7倍；其中AaLTP3与AaPDR2组合效果最佳，使青蒿醇、二氢青蒿醇和青蒿酸分别提高5.7、6.2和4.1倍。质外体排阻实验显示，AaLTP3可阻止约74%的外源青蒿酸进入细胞发生糖基化，联合AaPDR2时可达82%，而单独AaPDR2仅27%。此外，AaLTP3-GFP荧光在与通路及AaPDR2共表达时增强69%，提示其蛋白稳定性受通路活性正向调控。在农杆菌浸润13天后，坏死叶片中检测到青蒿素及青蒿素B的积累，而7天时尚未出现。该工作揭示脂质转运蛋白通过将萜类前体滞留于质外体、防止其回流糖化的新机制，为异源生产高价值萜烯提供了转运与区室化优化的新策略。
创新点
揭示了脂质转运蛋白（LTP）在质外体滞留萜类产物并防止其回流入细胞的新功能；筛选出黄花蒿AaLTP3和AaPDR2这一对高效的转运/滞留组合；通过共表达AaLTP3、AaPDR2与青蒿素通路基因，在本氏烟中实现了青蒿素和青蒿素B的瞬时生产；发现AaLTP3蛋白稳定性受青蒿素通路活性增强，提示其与通路存在功能互作。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成途径（AN-PW） | AaLTP3 | AaLTP3（脂质转移蛋白3） | 转运 | 在质外体滞留(二氢)青蒿酸，防止其回流入细胞；与AaPDR2协同效果最强；蛋白稳定性受通路活性增强。 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成途径（AN-PW） | AaLTP1 | AaLTP1（脂质转移蛋白1） | 转运 | 与AaLTP3相比对青蒿素前体的增强作用较弱。 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成途径（AN-PW） | AaLTP2 | AaLTP2（脂质转移蛋白2） | 转运 | 与AaLTP3相比对青蒿素前体的增强作用较弱。 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成途径（AN-PW） | AaPDR2 | AaPDR2（Pleiotropic Drug Resistance蛋白2） | 转运 | 定位在质膜，负责将青蒿素前体从胞内泵出到质外体；与AaLTP3协同增强积累。 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成途径（AN-PW） | AaPDR1 | AaPDR1（Pleiotropic Drug Resistance蛋白1） | 转运 | 质膜ABC转运蛋白，活性低于AaPDR2；GFP融合蛋白在BY-2细胞中未检测到。 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成途径（AN-PW） | ADS | Amorpha-4,11-diene synthase（紫穗槐二烯合酶） | 催化 | 催化法尼基焦磷酸环化生成紫穗槐-4,11-二烯，是青蒿素合成的第一步。 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成途径（AN-PW） | CYP71AV1 | CYP71AV1（紫穗槐二烯氧化酶） | 催化 | 细胞色素P450氧化酶，将紫穗槐二烯氧化为青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸。 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成途径（AN-PW） | DBR2 | DBR2（青蒿醛Δ11(13)还原酶） | 催化 | 催化青蒿醛还原为二氢青蒿醛。 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成途径（AN-PW） | ALDH1 | ALDH1（乙醛脱氢酶1） | 催化 | 催化二氢青蒿醛氧化为二氢青蒿酸。 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成途径（AN-PW） | HMGR（截短型tHMGR） | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 用于增强甲羟戊酸途径前体供应，提高青蒿素通路通量。 |
关键发现
['共表达AaLTPs+AaPDRs与AN-PW基因使叶片总提取物中AA含量增加2.1倍，AAA相对水平增加3.7倍。', '在质外体提取物中，AaLTPs+AaPDRs使AAOH增加2.4倍，DHAAOH增加2.5倍，DHAA增加1.7倍。', 'AN-PW*+AaPDR2+AaLTP3相比AN-PW+2xEV，使AAOH增加5.7倍，DHAAOH增加6.2倍，AAA增加4.1倍。', '在质外体中，AaLTP3+AaPDR2+AN-PW组合使AA增加2.6倍，DHAA增加5.3倍。', '质外体排阻实验表明，AaLTP3可阻止约74%的AA进入细胞转化为糖苷，AaLTP3+AaPDR2可阻止约82%，而单独AaPDR2仅阻止约27%。', 'AaLTP3-GFP荧光在与AN-PW+AaPDR2共表达时增加69%，表明其蛋白稳定性受通路活性影响。', '在13天农杆菌浸润后（dpi）的坏死叶片中检测到青蒿素（AN）和青蒿素B（AB）的积累，而7 dpi时未检测到终产物。']
研究结论
黄花蒿的脂质转运蛋白AaLTP3与PDR型ABC转运蛋白AaPDR2协同作用，将青蒿素前体（DH）AA从胞内转运到质外体并滞留其中，阻止其回流和糖基化，从而增强整个青蒿素通路的通量并最终使本氏烟瞬时产生青蒿素和青蒿素B。该发现为异源生物合成高价值萜烯提供了利用转运/区室化优化策略的新方向。