Production of bioactive ginsenosides Rh2 and Rg3 by metabolically engineered yeasts
- 作者
- Pingping Wang, Yongjun Wei, Yun Fan, Qunfang Liu, Wei Wei, Chengshuai Yang, Lei Zhang, Guoping Zhao, Jianmin Yue, Xing Yan, Zhihua Zhou
- 单位
- CAS- Key Laboratory of Synthetic Biology, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences; State Key Laboratory of Drug Research, Institute of Materia Medica, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences; State Key Laboratory of Genetic Engineering, Department of Microbiology, School of Life Sciences and Institute of Biomedical Sciences, Fudan University
- 杂志
- Metabolic Engineering（2015）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2015.03.003
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
人参皂苷Rh2和Rg3在人参中含量极低，且缺乏将原人参二醇（PPD）C3羟基糖基化的生物元件，无法通过合成生物学方法高效生产。
研究策略
从人参中克隆并鉴定两个UDP-糖基转移酶UGTPg45和UGTPg29，分别催化PPD C3羟基的糖基化和Rh2 C3葡萄糖的延伸；将这两个酶与PPD合成途径整合到酿酒酵母底盘细胞中，构建从葡萄糖从头合成Rh2和Rg3的酵母细胞工厂。
核心内容
本研究从人参中克隆并鉴定了两个UDP-糖基转移酶UGTPg45和UGTPg29，前者催化原人参二醇C3位羟基的糖基化生成Rh2，后者进一步延伸糖链形成Rg3。结合甲羟戊酸途径和达玛烯二醇/原人参二醇合成模块，在酿酒酵母中构建了从葡萄糖从头合成Rh2和Rg3的细胞工厂。酶学表征显示，UGTPg29对Rh2的Vmax达24624 nmol/min/mg，其kcat约为UGTPg45的2500倍。发酵结果显示，最高Rh2产量菌株可达1.45 μmol/g DCW，最高Rg3产量菌株为3.49 μmol/g DCW，同时优化后的PPD生产底盘产量达到8.29 μmol/g DCW，较初始菌株提升了3倍以上。该工作首次实现了人参皂苷Rh2和Rg3在酵母中的全生物合成，为替代传统植物提取方式、规模化生产稀有人参皂苷提供了可行路线。
创新点
首次鉴定出能选择性糖基化PPD C3羟基的UDP-糖基转移酶UGTPg45，以及能延伸四环三萜糖链形成1→2糖苷键的UGTPg29；实现了从葡萄糖在酵母中从头合成Rh2和Rg3。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4742及其衍生菌株 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | tHMG1 | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA还原酶） | 催化 | 过表达以增强PPD前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742及其衍生菌株 | 达玛烯二醇/原人参二醇生物合成途径 | PgDDS | 达玛烯二醇合酶 | 催化 | 催化2,3-氧化鲨烯环化生成达玛烯二醇 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742及其衍生菌株 | 达玛烯二醇/原人参二醇生物合成途径 | CYP716A47 (SynPgPPDS) | 原人参二醇合酶（CYP716A47） | 催化 | 催化达玛烯二醇C12位羟基化生成PPD |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742及其衍生菌株 | 达玛烯二醇/原人参二醇生物合成途径 | ATR2.1 | 细胞色素P450还原酶（来自拟南芥） | 催化 | 为CYP716A47提供电子 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742及其衍生菌株 | 甲羟戊酸（MVA）途径 / 类异戊二烯生物合成 | PgSQE1 | 鲨烯环氧酶 | 催化 | 催化鲨烯生成2,3-氧化鲨烯 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742及其衍生菌株 | 类异戊二烯生物合成 | ERG9 | 鲨烯合酶 | 催化 | 催化法尼基焦磷酸缩合生成鲨烯 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742及其衍生菌株 | 类异戊二烯生物合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成FPP |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742及其衍生菌株 | 人参皂苷糖基化途径 | UGTPg45 | UDP-糖基转移酶UGTPg45 | 催化 | 选择性转移葡萄糖到PPD的C3羟基生成Rh2 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742及其衍生菌株 | 人参皂苷糖基化途径 | UGTPg29 | UDP-糖基转移酶UGTPg29 | 催化 | 选择性转移葡萄糖到Rh2的C3葡萄糖形成1→2糖苷键生成Rg3 |
关键发现
- UGTPg29的kcat（1111.5 s^-1）是UGTPg45（0.384 s^-1）的2500倍以上；最高Rh2产量菌株D20RH18产Rh2
- 45 μmol/g DCW；最高Rg3产量菌株D20RG1产Rg3
- 49 μmol/g DCW；PPD生产底盘ZW-PPD-B产PPD
- 29 μmol/g DCW，是ZW-PPD-A的3倍以上；UGTPg45对PPD的Vmax为80 nmol/min/mg，Km为209 μM；UGTPg29对Rh2的Vmax为24624 nmol/min/mg，Km为149 μM。
研究结论
通过构建酵母细胞工厂，实现了从葡萄糖发酵生产人参皂苷Rh2和Rg3，为替代从人参植物中提取的传统方法提供了新途径。