Engineering Methylobacterium extorquens for de novo synthesis of the sesquiterpenoid α-humulene from methanol
- 作者
- Frank Sonntag, Cora Kroner, Patrice Lubuta, Rémi Peyraud, Angelika Horst, Markus Buchhaupt, Jens Schrader
- 单位
- DECHEMA Research Institute, Theodor-Heuss-Allee 25, Frankfurt am Main 60486, Germany; INRA, Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes (LIPM), UMR441, F-31326 Castanet-Tolosan, France; CNRS, Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes (LIPM), UMR2594, F-31326 Castanet-Tolosan, France
- 杂志
- Metabolic Engineering（2015）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2015.09.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
以糖为碳源生产萜类化合物存在与粮食竞争且价格波动大的问题。本研究旨在利用非食物碳源甲醇，通过代谢工程改造甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1，实现倍半萜α-humulene的从头合成，验证甲醇作为替代碳源的可行性。
研究策略
以甲醇为唯一碳源，在M. extorquens AM1中表达来自Zingiber zerumbet的α-humulene合酶（zssl）和来自Saccharomyces cerevisiae的FPP合酶（ERG20）；引入来自Myxococcus xanthus的完整原核甲羟戊酸（MVA）途径以增强异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）供给；通过核糖体结合位点（RBS）优化（zssl TIR=221625, ERG20 TIR=20000/35000, fni TIR=65000）平衡代谢通量，避免有毒中间体积累；使用类胡萝卜素合成缺陷突变株CM502减少前体FPP向类胡萝卜素的分流；最后通过甲醇限制的补料分批发酵实现高密度培养。
核心内容
本研究以甲醇为唯一碳源，改造甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1实现倍半萜α-humulene的从头合成。通过在菌株中异源表达来自生姜的α-humulene合酶（zssl）和酿酒酵母的FPP合酶（ERG20），并引入来源于Myxococcus xanthus的完整原核甲羟戊酸（MVA）途径增强IPP和DMAPP前体供给，同时利用核糖体结合位点优化平衡代谢通量，避免有毒中间体积累。进一步采用类胡萝卜素合成缺陷突变株CM502减少前体FPP的分流，最终通过甲醇限制的补料分批发酵，α-humulene最高产量达1.65 g/L，为当时报道的从头合成最高滴度，最大底物产率为0.031 g/g甲醇，相当于理论最大产率的12%。研究表明，M. extorquens能耐受高达1 g/L的α-humulene浓度且无生长抑制，展示了该菌株作为以非食物碳源甲醇生产高价值萜类化合物的平台潜力，为开拓不依赖糖类原料的生物制造路线提供了可行范例。
创新点
['首次在甲基营养菌中实现从甲醇从头合成倍半萜α-humulene，并达到g/L级产量。', '引入并优化了来自Myxococcus xanthus的完整原核MVA途径，解决了异源途径的毒性问题。', '利用类胡萝卜素合成缺陷菌株提高前体供应，增加产物产量。', '通过补料分批发酵使α-humulene最高产量达1.65 g/L，为当时报道的最高从头合成滴度。']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Methylobacterium extorquens AM1 | α-humulene合成途径 | zssl | α-humulene合酶 | 催化 | 来源于Zingiber zerumbet，经密码子优化和RBS优化（TIR=221625） |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 萜类前体FPP合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 来源于Saccharomyces cerevisiae，RBS优化（TIR=20000或35000） |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 甲羟戊酸途径（MVA） | hmgs | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶 | 催化 | 来源于Myxococcus xanthus |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 甲羟戊酸途径（MVA） | hmgr | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 来源于Myxococcus xanthus |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 甲羟戊酸途径（MVA） | mvaK | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来源于Myxococcus xanthus |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 甲羟戊酸途径（MVA） | mvaK2 | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来源于Myxococcus xanthus |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 甲羟戊酸途径（MVA） | mvaD | 焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶 | 催化 | 来源于Myxococcus xanthus |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 甲羟戊酸途径（MVA）/异戊烯基焦磷酸异构化 | fni | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 来源于Myxococcus xanthus，RBS优化（TIR=65000） |
| Methylobacterium extorquens CM502 | 类胡萝卜素合成途径 | crtNb | 类胡萝卜素氧化酶 | 调控 | 突变菌株中缺失，阻断类胡萝卜素合成以减少FPP分流，提高α-humulene产量 |
关键发现
['组成型表达zssl和ERG20时α-humulene产量为2.3 mg/L。', '使用pQ2148诱导型启动子系统，pFS49（zssl）产量为11 mg/L，pFS50（zssl+ERG20）为17 mg/L。', 'RBS优化并引入MVA途径后，摇瓶产量达58 mg/L。', '采用类胡萝卜素合成缺陷菌株CM502后，摇瓶产量进一步增至75 mg/L。', '甲醇限制补料分批发酵中，AM1_pFS62b最高产量1.02 g/L，CM502_pFS62b最高产量1.65 g/L，为迄今报道的最高从头合成α-humulene滴度。', '最大底物产率为0.031 g/g甲醇，相当于理论最大产率（0.26 g/g）的12%。', 'α-humulene浓度高达1 g/L时对M. extorquens AM1无生长抑制作用。']
研究结论
本研究成功将模式甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1改造为以甲醇为碳源生产倍半萜α-humulene的平台菌株。通过组合异源α-humulene合酶、FPP合酶、MVA途径及RBS优化，并利用类胡萝卜素缺陷突变株和补料分批发酵，最终实现1.65 g/L的α-humulene产量，这是目前报道的从头合成α-humulene的最高水平。该工作展示了M. extorquens作为未来高价值萜类化合物生产平台的潜力，为利用非食物碳源甲醇进行生物制造提供了范例。