Construction of lycopene-overproducing Saccharomyces cerevisiae by combining directed evolution and metabolic engineering
- 作者
- Wenping Xie, Xiaomei Lv, Lidan Ye, Pingping Zhou, Hongwei Yu
- 单位
- Institute of Bioengineering, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University; Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, Zhejiang University
- 杂志
- Metabolic Engineering（2015）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2015.04.009
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中增强FPP供应后，异源类胡萝卜素途径能力不足导致FPP流向副产物，如何构建畅通的番茄红素合成途径以实现高产。
研究策略
结合定向进化和代谢工程，筛选不同来源的八氢番茄红素合成酶，通过定向进化失活CrtYB的环化酶功能并优化CrtE，调整Crt基因拷贝数，构建原养型二倍体菌株，并采用补料分批发酵。
核心内容
本研究以酿酒酵母为底盘，针对法尼基焦磷酸供应增强后异源类胡萝卜素途径通量不足的问题，将定向进化与代谢工程相结合构建番茄红素高产区。作者筛选了不同来源的八氢番茄红素合成酶，通过定向进化获得仅保留合成酶功能而丧失环化酶活性的CrtYB突变体，并发现CrtE中的一个沉默突变C81T可通过提高蛋白表达将番茄红素积累提升4倍。在此基础上调整Crt基因拷贝数并过表达截短HMG-CoA还原酶，逐步将番茄红素产量提升至9.67 mg/g DCW，增加CrtI拷贝后进一步达17.46 mg/g DCW。最终构建的原养型二倍体菌株YXWPD-14在摇瓶中产量为23.23 mg/g DCW，5 L补料分批发酵中达到1.61 g/L（24.41 mg/g DCW），角鲨烯副产物低于1 mg/g DCW，为当时工程酵母报道的最高水平。该工作表明组合运用蛋白工程、拷贝数优化和倍性改造能有效疏通合成途径，对生产具有细胞毒性的萜类分子具有参考意义。
创新点
1. 通过定向进化获得仅具有八氢番茄红素合成酶功能的CrtYB突变体（如CrtYB01M/11M）；2. 发现CrtE的沉默突变C81T可提高蛋白表达从而增强番茄红素合成；3. 综合运用蛋白工程、基因拷贝数调整和发酵控制，实现工程酵母中迄今最高的番茄红素产量。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达以增强FPP前体供应 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | CrtYB | 双功能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，经定向进化失活环化酶功能获得CrtYB11M突变体 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | CrtE | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 (GGPPS) | 催化 | 来自X. dendrorhous，经定向进化获得CrtE03M突变体，含有沉默突变C81T |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | CrtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自X. dendrorhous，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | CrtB | 八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，作为对照来源 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | PSY1 | 八氢番茄红素合成酶1 | 催化 | 来自番茄，因亚细胞定位和密码子偏好而在酵母中表现不佳 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | PSY2 | 八氢番茄红素合成酶2 | 催化 | 来自番茄，因亚细胞定位和密码子偏好而在酵母中表现不佳 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成途径（竞争途径） | ERG9 | 角鲨烯合酶 | 催化 | 竞争FPP生成角鲨烯，本文通过增强番茄红素途径竞争FPP而非直接抑制ERG9 |
| Saccharomyces cerevisiae | GAL调控系统 | GAL80 | — | 调控 | 破坏GAL80使GAL启动子受葡萄糖调控，用于分阶段发酵 |
关键发现
- 野生型CrtYB的总类胡萝卜素产量约为CrtB表达菌株的2.4倍
- 表达CrtYB01M的菌株番茄红素产量为2.53 mg/g DCW，约为CrtB过表达菌株的3倍
- 整合CrtYB11M、CrtE、CrtI和tHMG1的菌株YXWP-P3-01产生4.47 mg/g DCW番茄红素和25.66 mg/g DCW角鲨烯
- CrtE03M表达菌株的番茄红素积累为野生型CrtE的4倍，其沉默突变C81T（CAU vs CAC，使用频率13.6% vs
- 8%）是主要原因
- YXWP-111(+)的番茄红素产量为9.67 mg/g DCW，是YXWP-P3-01的2.2倍，角鲨烯降至10.23 mg/g DCW
- 增加CrtI拷贝使YXWP-136(+)的番茄红素产量提高80.6%至17.46 mg/g DCW，角鲨烯降至7.17 mg/g DCW
- 二倍体原型菌株YXWPD-14在摇瓶培养中OD600为23.408，番茄红素产量为23.23 mg/g DCW（159.56 mg/L）
- 5 L发酵罐补料分批发酵中，最终番茄红素产量达到1.61 g/L（24.41 mg/g DCW），角鲨烯副产物低于1 mg/g DCW，为当时工程酵母报道的最高产量。
研究结论
通过定向进化增强关键酶活性、调整基因拷贝数以及构建二倍体菌株等组合策略，成功构建了高产的番茄红素酿酒酵母菌株，最终产量达24.41 mg/g DCW（1.61 g/L），为工程酵母中最高水平，验证了该策略对于构建畅通生物合成途径的有效性，尤其适用于生产具有细胞毒性的分子。