Elimination of metabolic pathways to all traditional fermentation products increases ethanol yields in Clostridium thermocellum
- 作者
- Bethyl Papanek, Ranjita Biswas, Thomas Rydzak, Adam M Guss
- 单位
- Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory; BioEnergy Science Center, Oak Ridge National Laboratory; Bredesen Center for Interdisciplinary Research and Graduate Education, University of Tennessee - Knoxville
- 杂志
- Metabolic Engineering（2015）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2015.09.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
嗜热厌氧细菌Clostridium thermocellum天然能转化纤维素产乙醇，但副产物乳酸、甲酸、乙酸和氢气会分流碳和电子，并导致培养基酸化抑制发酵，限制乙醇产量和滴度。
研究策略
通过组合敲除ldh、pfl（pflB+pflA）、pta-ack和hydG基因，构建多基因缺失菌株AG553（Δhpt ΔhydG Δldh Δpfl Δpta-ack），消除有机酸产生并降低氢气产量，将碳和电子流转向乙醇合成途径。
核心内容
该研究通过组合敲除嗜热厌氧菌Clostridium thermocellum中乳酸、甲酸、乙酸和氢气等传统发酵副产物的形成基因（ldh、pflB/pflA、pta-ack和hydG），构建了多基因缺失菌株AG553，旨在消除碳和电子分流以及培养基酸化，将代谢流导向乙醇合成。在5 g/L Avicel上，AG553乙醇产量达到39.1 mM（63.5%理论产率），而野生型仅为12.3 mM（19.9%）；在预处理杨木和柳枝稷上，AG553分别达到23.8 mM（62.6%）和16.6 mM（52.4%）的理论产率，均显著高于野生型。氢气产量降低约5倍，在20 g/L Avicel下最高乙醇滴度达73.4 mM，而野生型最大仅14.1 mM。该菌株在多种底物上实现了迄今最高的乙醇产量，有效减少了碳和电子流失及酸抑制，可作为整合生物加工（CBP）的优良平台菌株，为木质纤维素乙醇生产提供了重要基础。
创新点
首次在C. thermocellum中同时消除所有传统发酵副产物（乳酸、甲酸、乙酸和大部分氢气）的代谢途径；获得的菌株AG553在模型底物和预处理生物质上均实现了迄今为止最高乙醇产量；该菌株可作为CBP平台菌株。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium thermocellum | 乳酸发酵 | ldh | 乳酸脱氢酶 (Ldh) | 催化 | Clo1313_1160；敲除以消除乳酸产生 |
| Clostridium thermocellum | 甲酸发酵 | pflB | 丙酮酸甲酸裂解酶 (PflB) | 催化 | Clo1313_1717；敲除以消除甲酸产生 |
| Clostridium thermocellum | 甲酸发酵 | pflA | Pfl激活酶 (PflA) | 调控 | Clo1313_1716；与pflB一起敲除，失活Pfl |
| Clostridium thermocellum | 乙酸发酵 | pta | 磷酸转乙酰酶 (Pta) | 催化 | Clo1313_1185；与ack一起敲除，阻断乙酸生成 |
| Clostridium thermocellum | 乙酸发酵 | ack | 乙酸激酶 (Ack) | 催化 | Clo1313_1186；与pta一起敲除，阻断乙酸生成 |
| Clostridium thermocellum | 氢代谢 | hydG | 氢化酶成熟酶 (HydG) | 调控 | 敲除导致三种[FeFe]氢化酶失活，H2产量降低约5倍 |
| Clostridium thermocellum | 氢代谢/能量代谢 | ech | 能量转换氢化酶 (Ech) | 能量供给 | NiFe氢化酶；尝试敲除未成功，仍有少量H2产生；与氧化还原平衡相关 |
| Clostridium thermocellum | 乙醇发酵 | adhE | 双功能醛/醇脱氢酶 (AdhE) | 催化 | D494G自发突变使醇脱氢酶活性从仅用NADH扩展为可用NADH和NADPH，促进乙醇合成 |
关键发现
- 在5 g/L Avicel上，AG553乙醇产量为39.1 mM（63.5%理论产率），野生型仅12.3 mM（19.9%理论产率）
- 在5 g/L cellobiose上，AG553产乙醇32.8 mM（56.1%理论产率），野生型17.7 mM（30.3%理论产率）
- 在预处理杨木和柳枝稷上，AG553乙醇产量分别为23.8 mM（62.6%理论产率）和16.6 mM（52.4%理论产率），而野生型仅为13.4 mM（35.3%）和9.1 mM（26%）
- 氢气产量降低约5倍
- 在20 g/L Avicel下AG553最高乙醇滴度达73.4 mM，野生型最大滴度仅为14.1 mM（10 g/L Avicel）
- 在1 g/L Avicel下AG553达到77.9%理论产率。
研究结论
通过组合敲除副产物形成途径，菌株AG553成为当前乙醇产量最高的C. thermocellum菌株，有效减少培养基酸化和碳/电子流失，适合作为进一步代谢工程改造的平台菌株，用于木质纤维素生物转化的整合生物加工。