Identification of novel isoprene synthases through genome mining and expression in Escherichia coli
- 作者
- Marja Ilmén, Merja Oja, Anne Huuskonen, Sangmin Lee, Laura Ruohonen, Simon Jung
- 单位
- VTT Technical Research Centre of Finland Ltd, P.O. Box 1000, FI-02044 VTT, Espoo, Finland; Global Technology, SK innovation, Daejeon, Republic of Korea
- 杂志
- Metabolic Engineering（2015）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2015.08.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
现有异戊二烯合酶（IspS）来源有限且性能不佳，制约了微生物发酵生产异戊二烯的工业化应用，需要挖掘并验证新的高性能异戊二烯合酶。
研究策略
以已知异戊二烯合酶序列为探针，对公共数据库（包括RNA-seq来源的tsa_nt等）进行同源序列检索；通过系统发育分析、保守基序和'isoprene score'关键氨基酸筛选候选基因；将候选基因在大肠杆菌中异源表达，并通过顶空气相色谱-质谱联用检测异戊二烯产量以验证酶活性。
核心内容
本研究通过基因组挖掘策略在公共数据库中检索已知异戊二烯合酶的同源序列，经CD-HIT聚类和系统发育分析从9123条序列中锁定618条候选基因，最终选取9个在大肠杆菌中异源表达并通过顶空气相色谱-质谱验证功能。结果首次证实甘薯、芒果和Elaeocarpus photiniifolius来源的三个萜烯合酶具有异戊二烯合酶活性，其与已知酶的氨基酸一致性均不超过65%。其中甘薯IspS在37°C下异戊二烯生产速率达40 μg/L·h，为银白杨IspS的两倍，优于已报道的葛藤和银白杨酶，是微生物异戊二烯生产的优良候选。研究还发现F338为功能必需残基但非充分条件，且N端StrepII标签可提升蛋白表达和产量。该工作拓展了异戊二烯合酶的序列多样性，所建立的筛选流程可推广至其他酶家族，为异戊二烯生物合成提供了新的高效催化元件。
创新点
['首次证实了来自甘薯（Ipomoea batatas）、芒果（Mangifera indica）和Elaeocarpus photiniifolius的三个萜烯合酶具有异戊二烯合酶活性', '建立了可扩展的序列检索-聚类-系统发育-功能筛选的基因组挖掘流程，适用于任何酶家族', '发现F338是功能性异戊二烯合酶的关键氨基酸之一，但仅引入F338不足以保证活性', '鉴定出I. batatas IspS在E. coli中性能优于已知的P. alba IspS，是微生物异戊二烯生产的优良候选']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)Star | — | — | — | — | 宿主菌株，用于异戊二烯合酶异源表达和产物检测 |
| — | 内源MEP途径（提供DMAPP） | — | — | — | E. coli内源甲基赤藓醇磷酸途径为异戊二烯合成提供前体DMAPP |
| — | 异戊二烯合成（DMAPP→异戊二烯） | IspS（来自Ipomoea batatas，GenBank JP105673.1） | 甘薯异戊二烯合酶 | 催化 | 新鉴定，isoprene score 4，产率40 μg/L·h（37°C），性能最佳 |
| — | 异戊二烯合成（DMAPP→异戊二烯） | IspS（来自Elaeocarpus photiniifolius，GenBank FX134022.1） | Elaeocarpus photiniifolius异戊二烯合酶 | 催化 | 新鉴定，isoprene score 4，添加N端StrepII标签可提高产量 |
| — | 异戊二烯合成（DMAPP→异戊二烯） | IspS（来自Mangifera indica，GenBank GBCV01019670.1） | 芒果异戊二烯合酶 | 催化 | 新鉴定，isoprene score 3，含F338，N505突变为Ser |
| — | 异戊二烯合成（DMAPP→异戊二烯） | IspS（来自Populus alba，Uniprot Q50L36） | 银白杨异戊二烯合酶 | 催化 | 已知对照，产率约20 μg/L·h（37°C） |
| — | 异戊二烯合成（DMAPP→异戊二烯） | IspS（来自Pueraria montana，Uniprot Q6EJ97） | 葛藤异戊二烯合酶 | 催化 | 已知对照，已报道产率22 μg/L·h |
| — | 异戊二烯合成（DMAPP→异戊二烯） | IspS（来自Arachis hypogaea，专利WO2013/166320 SEQ ID 3） | 花生异戊二烯合酶 | 催化 | 蛋白表达但本实验条件下未检测到异戊二烯 |
关键发现
- 通过同源搜索共获得9123条序列，经CD-HIT聚类（≥80%同一性）后得到1929条代表序列
- 进一步分析确定618条候选IspS，最终选出9个候选基因进行功能验证。其中Ipomoea batatas、Elaeocarpus photiniifolius和Mangifera indica的IspS首次被证明具有异戊二烯合酶活性。I. batatas IspS在37°C下异戊二烯生产速率达40 μg/L·h，为P. alba IspS（约20 μg/L·h）的2倍
- 已知P. montana和P. alba IspS分别报道为22 μg/L·h和33 μg/L·h。三个新IspS与已知IspS的氨基酸一致性均≤65%（I. batatas与Q. petraea一致性55%，E. photiniifolius 60%，M. indica 65%）。所有功能性IspS均含有F338，但A. hypogaea IspS虽含F338且蛋白表达，在实验条件下未检测到异戊二烯
- 非功能性候选（F. vesca、M. notabilis、D. pinnata、M. sativa、E. grandis、S. indicum）均缺少F338。对M. notabilis和E. grandis引入F338突变未恢复活性。给E. photiniifolius IspS添加N端StrepII标签可显著提高蛋白表达量和异戊二烯产量。
研究结论
通过序列同源挖掘及大肠杆菌功能表达，成功鉴定了三个新的异戊二烯合酶，其中I. batatas IspS在E. coli中表现出优异的异戊二烯生产能力，优于已有报道的P. alba和P. montana酶，为微生物异戊二烯工厂提供了有前景的新催化元件。