Introduction of a bacterial acetyl-CoA synthesis pathway improves lactic acid production in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Ji-Yoon Song, Joon-Song Park, Chang Duk Kang, Hwa-Young Cho, Dongsik Yang, Seunghyun Lee, Kwang Myung Cho
- 单位
- Biomaterials Laboratory, Material Research Center, Samsung Advanced Institute of Technology, Gyeonggi-do, Republic of Korea
- 杂志
- Metabolic Engineering（2015）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2015.09.006
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中敲除乙醇脱氢酶ADH1虽然提高了乳酸产率，但导致细胞生长和葡萄糖消耗速率严重下降，总生产力降低。其原因可能是乙酰-CoA供应不足，影响细胞生长。需要寻找新的策略来恢复Δadh1菌株的生长和生产力。
研究策略
通过在乳酸生产酿酒酵母中引入细菌来源的乙酰化乙醛脱氢酶（A-ALD，如MhpF和EutE），将乙醛直接转化为乙酰-CoA，替代内源耗能的ALD-ACS途径，同时敲除ALD6以减少乙酸生成，从而增加乙酰-CoA供应、节省ATP，改善细胞代谢，提高乳酸生产力和产率。
核心内容
本研究在酿酒酵母中引入细菌来源的乙酰化乙醛脱氢酶（MhpF和EutE），将乙醛直接转化为乙酰-CoA，替代内源耗能的ALD-ACS旁路，以解决敲除ADH1后乙酰-CoA供应不足导致的生长和生产力下降问题。通过敲除ALD6消除乙酸副产物并组合表达MhpF与EutE，显著提高A-ALD活性，胞内乙酰-CoA水平达到对照菌株的1.8倍，ATP水平近乎翻倍，同时葡萄糖消耗提高约27%。最优菌株SP1130在2-L补料分批发酵中40小时产乳酸142 g/L，产率0.89 g/g，生产力3.55 g/L/h，较对照提高约20%，且副产物乙酸低于0.1 g/L。结果表明，以节能方式补充乙酰-CoA可有效恢复弱化乙醇途径酵母的代谢活性，该策略为工业乳酸生产菌株的乙酰-CoA供给优化提供了通用方案。
创新点
['首次在乳酸生产酵母中引入细菌乙酰化乙醛脱氢酶途径，替代内源ALD-ACS途径，实现无ATP消耗的乙酰-CoA合成。', '通过敲除ALD6消除乙酸副产物，并将MhpF与EutE组合表达，使A-ALD活性显著提高。', '在补料分批发酵中实现142 g/L乳酸、0.89 g/g产率及3.55 g/L/h生产力，比对照提高约20%。', '揭示乙酰-CoA供应对弱化乙醇途径的酵母生长和生产力的关键作用，提供一种节能的乙酰-CoA工程策略。']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 乳酸合成途径 | LDH (Pelodiscus sinensis japonicas) | L-乳酸脱氢酶 | 催化 | 异源表达，催化丙酮酸还原为L-乳酸 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 乳酸合成途径 | LDH (Bos taurus) | L-乳酸脱氢酶 | 催化 | 异源表达，催化丙酮酸还原为L-乳酸 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 乙醇合成途径 | PDC1 | 丙酮酸脱羧酶1 | 催化 | 敲除，减少乙醇生成 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 乳酸代谢途径 | CYB2 | 细胞色素-c氧化还原酶2（L-乳酸脱氢酶） | 催化 | 敲除，防止乳酸被氧化回丙酮酸 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 甘油合成途径 | GPD1 | 甘油-3-磷酸脱氢酶1 | 催化 | 敲除，减少甘油生成 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 乙醇合成途径 | ADH1 | 乙醇脱氢酶1 | 催化 | 敲除，减少乙醇生成，但导致生长和葡萄糖消耗速率下降 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 乙酰-CoA合成途径（PDH旁路） | ALD6 | 乙醛脱氢酶6 | 催化 | 敲除，减少乙酸生成 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 乙酰-CoA合成途径 | SeACS | 乙酰-CoA合成酶（L641P突变体） | 催化 | 过表达，但未提高乳酸产量，可能因高耗能 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 异源乙酰-CoA合成途径 | mhpF | 乙酰化乙醛脱氢酶 MhpF | 催化 | 异源表达，将乙醛直接转化为乙酰-CoA，无需ATP |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 异源乙酰-CoA合成途径 | eutE | 乙酰化乙醛脱氢酶 EutE | 催化 | 异源表达，比MhpF活性更高，在SP1130中表达 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 乙醇合成途径 | ADH2 | 乙醇脱氢酶2 | 催化 | 敲除，减少乙醇生成，提高乳酸产率（SP1175） |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 乙醇合成途径 | ADH6 | 乙醇脱氢酶6 | 催化 | 敲除，进一步减少乙醇，但影响葡萄糖消耗（SP2065/SP2075） |
关键发现
- ['SP2005（pdc1Δ cyb2Δ gpd1Δ LDH）在微好氧摇瓶中产生40 g/L乳酸和15 g/L乙醇，乳酸产率0.5 g/g。', '敲除ADH1得到SP2006，乙醇降至1.4 g/L，乳酸25 g/L，产率0.78 g/g，但比生长速率降低26%（0.28 vs
- 38 h-1）。', '过表达ALD6和SeACS(L641P)的SP1050未改善乳酸生产，补料分批中乳酸产量反而降低10-20%。', '在SP1061（表达mhpF）基础上敲除ALD6得到SP1081，乙酸降至不可检测，葡萄糖消耗提高约27%，乳酸产量提高约30%，产率超过0.8 g/g。', '表达eutE的SP1130在摇瓶中葡萄糖消耗44 g/L，乳酸37 g/L，产率0.85 g/g。', 'SP1130在2-L补料分批发酵中40 h产生142 g/L乳酸，产率0.89 g/g，生产力3.55 g/L/h；乙醇约8 g/L，甘油0.7 g/L，乙酸<0.1 g/L。', '胞内代谢物分析显示，SP1130的乙酰-CoA水平是SP2006的1.8倍（2.91 vs
- 61 nmol/10^8 cells），ATP水平几乎两倍（157.9 vs
- 0 nmol/10^8 cells）。', '进一步敲除ADH2（SP1175）使乳酸产率提高至0.9 g/g，但敲除ADH2和ADH6（SP2075）导致葡萄糖消耗下降，乳酸产量降低75%。']
研究结论
引入细菌乙酰化乙醛脱氢酶途径，在Δadh1乳酸生产酵母中以节能方式补充乙酰-CoA，可有效恢复细胞代谢活性，显著提高乳酸生产力和产率。该策略对开发弱化乙醇途径的工业酵母菌株具有广泛适用性。