A phycocyanin- phellandrene synthase fusion enhances recombinant protein expression and β-phellandrene (monoterpene) hydrocarbons production in Synechocystis (cyanobacteria)
- 作者
- Cinzia Formighieri, Anastasios Melis
- 单位
- Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, CA 94720-3102, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2015）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2015.09.010
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
蓝藻中异源萜烯合酶表达水平低，导致β-水芹烯等萜烯产物产量低；仅靠强启动子不足以实现高表达，需要大幅提高重组酶浓度以弥补其低催化速率。
研究策略
将β-水芹烯合酶（PHLS）与蓝藻内源高表达的藻蓝蛋白β亚基（CpcB）或异源高表达基因NPTI编码序列融合，在cpc启动子驱动下表达融合蛋白，利用高表达前导序列促进重组蛋白积累。
核心内容
针对蓝藻中异源萜烯合酶表达水平低导致β-水芹烯产量不足的问题，本研究将β-水芹烯合酶（PHLS）分别与蓝藻内源高表达藻蓝蛋白β亚基（CpcB）及异源新霉素磷酸转移酶（NPTI）编码序列融合，在cpc启动子驱动下于集胞藻PCC 6803中表达。结果显示，CpcB·PHLS融合蛋白在cpcB·PHLS+cpc转化株中积累至总细胞蛋白约20%，β-水芹烯平均产量达3.2 mg/g dcw，较低表达的Δcpc+cpcB·PHLS株（0.03 mg/g dcw）提高100倍；NPTI·PHLS融合蛋白积累约5%，产量为0.64 mg/g dcw。体外酶活测定表明总提取物和沉淀部分的合成速率分别为72和78 μg/g dcw/h。产物可自发漂浮于培养液表面，便于收集。该融合策略显著提升重组酶积累量及单萜产量，为光合微生物生产萜烯类化合物提供了可行方案。
创新点
提出融合蛋白策略增强蓝藻中异源萜烯合酶表达，使CpcB·PHLS融合蛋白最高积累至总细胞蛋白约20%，显著提高β-水芹烯产量，且产物自发漂浮于培养液表面便于收集。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | — | — | — | 能量供给 | 光合自养底盘细胞，提供还原力和碳骨架用于产物合成 |
| — | 萜类合成途径（MEP途径） | — | — | 能量供给 | 内源甲基赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径，为β-水芹烯合成提供GPP前体 |
| — | — | PHLS | β-水芹烯合酶（PHLS） | 催化 | 催化GPP生成β-水芹烯，来源于薰衣草，经密码子优化异源表达 |
| — | — | cpcB | 藻蓝蛋白β亚基（CpcB） | 调控 | 作为融合标签，显著促进下游PHLS蛋白高水平积累 |
| — | — | NPTI | 新霉素磷酸转移酶（NPTI） | 调控 | 作为高表达前导序列，融合后使PHLS积累至总蛋白约5% |
| — | — | cpcA | 藻蓝蛋白α亚基（CpcA） | 调控 | 其存在对CpcB·PHLS融合蛋白高水平积累（约20%总蛋白）是必需的 |
关键发现
- CpcB·PHLS融合蛋白在cpcB·PHLS+cpc转化株中积累至总蛋白的约20%
- β-水芹烯产量平均达3.2 mg/g dcw，相较低表达Δcpc+cpcB·PHLS株的0.03 mg/g dcw提高100倍
- NPTI·PHLS融合蛋白积累约5%，产量为0.64 mg/g dcw
- 体外酶活测定显示总提取物和沉淀部分的β-水芹烯合成速率分别为72 μg/g dcw/h和78 μg/g dcw/h（标准差±20%）
- 野生型无产物生成，GC-FID确认主要产物为β-水芹烯，副产物为β-月桂烯。
研究结论
将萜烯合酶与高表达蛋白融合是一种有效策略，可显著提高蓝藻中重组酶积累量及β-水芹烯烃产量，为利用光合微生物生产萜烯类产品提供了可行方案。